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[背景与目的]1999年Maniotis[1]]第一次在高侵袭性的黑色素瘤中发现了一种新的管道样结构,被称为血管生成拟态（vasculogenic mimiory VM）。构成血管生成拟态的管壁如:层粘连蛋白、肝素硫酸盐蛋白多糖、Ⅳ胶原蛋白等是富含PAS染色阳性的细胞外基质,其血管内皮细胞特异标记免疫组化染色（FVlllRag、Ules、cD31、CD34、KDR等）阴性。这些通道与肿瘤血管相连,为肿瘤组织提供血供。血管生成拟态与内皮依赖血管最显著区别是,内皮细胞围成的血管CD31染色阳性而PAS染色阴性,而血管生成拟态管壁呈PAS阳性而CD31染色阴性。miRNAs与血管生成拟态在恶性肿瘤的转移中起着重要作用,相关研究发现miRNAs可以通过调节血管生成拟态的形成而引起恶性肿瘤侵袭性、转移能力的改变。但血管生成拟态和miRNAs之间的具体关系以及调控信号通路尚未明确。我们研究团队前期研究发现:肺癌患者血液中miR-9-5P较肺良性肿瘤患者显著上调、miR-9-5P在肺癌癌组织中较癌旁正常肺组织中显著上调。相关研究报道miR-9-5P可以调节恶性肿瘤血管生成拟态的形成,但在肺癌研究中的相关报道很少。本研究拟测定NSCLC组织中miR-9-5P的表达和血管生成拟态的形成情况,通过体内、体外实验,探究上调、下调miR-9-5P对NSCLC增殖、迁移、侵袭等和血管生成拟态形成的影响,初步探究miR-9-5P的靶基因及相关通路,探讨miR-9-5P在NSCLC中扮演的角色及其作用机制,希望为肺癌诊断、靶向药物设计提供实验依据。[方法]1.人NSCLC组织中miR-9-5P的表达和血管生成拟态形成情况及临床意义收集60例手术治疗的NSCLC癌组织及配对远端正常肺组织,应用qPCR检测NSCLC癌组织及配对远端正常肺组织中miR-9-5P的表达情况,并分析其与临床病理特征之间的关系;应用免疫组化、CD31/PAS双重染色方法检测NSCLC癌组织中血管生成拟态的形成情况,并分析其与临床病理特征之间的关系。2.miR-9-5P对NSCLC细胞生物学功能的影响以A549、NCI-H1299为实验细胞株,通过质粒转染的方法分别上调及下调miR-9-5P,并筛选出相应的稳定转染细胞株,qPCR验证miR-9-5P转染效率;CCK-8实验、细胞克隆形成实验、划痕试验、Transwell侵袭试验、细胞凋亡检测实验、三维细胞培养实验检测miR-9-5P对NSCLC的增殖、克隆、迁移、侵袭、凋亡及管道形成能力的影响。3.miR-9-5P在NSCLC和血管生成拟态形成中的分子机制研究应用TargetScan、PicTar和miRanda基因预测软件筛选miR-9-5P的靶基因,再用双荧光素酶报告基因实验进行验证;Western Blot检测稳定上调、下调miR-9-5P的NSCLC细胞株中E-cadherin的表达;Western Blot检测不同miR-9-5P水平的肺癌癌组织中E-cadherin的表达,验证miR-9-5P与E-cadherin的相关性。Western Blot检测稳定上调、下调miR-9-5P的NSCLC细胞株中血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达;Western Blot检测不同miR-9-5P水平的肺癌癌组织中VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达,验证miR-9-5P对NSCLC中血管生成拟态相关蛋白的影响。4.miR-9-5P对裸鼠NSCLC移植瘤和移植瘤中血管生成拟态形成的影响研究以稳定上调、下调miR-9-5P的A549、NCI-H1299为实验细胞株,构建裸鼠皮下移植瘤模型,比较上调、下调miR-9-5P对NSCLC细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响;应用免疫组化、CD31/PAS双染检测不同miR-9-5P水平移植瘤中血管生成拟态的形成情况,比较上调、下调miR-9-5P对裸鼠移植瘤中血管生成拟态形成能力的影响;免疫组化、Western Blot检测裸鼠移植瘤中EMT发生的关键蛋白E-cadherin的表达情况;免疫组化、Western Blot检测裸鼠移植瘤中血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达情况,比较上调、下调miR-9-5P对裸鼠移植瘤中EMT关键蛋白E-cadherin和血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的影响,进一步验证miR-9-5P对NSCLC和血管生成拟态形成的影响。[结果]1.人NSCLC组织中miR-9-5P的表达和血管生成拟态形成情况及临床意义NSCLC患者的癌组织中miR-9-5P较癌旁正常肺组织明显上调;miR-9-5P上调明显组与miR-9-5P上调不明显组相比:鳞癌比率更高、Ⅲ期比率更高,但差异无统计学意义（P>0.05）,低分化癌比率更高（P<0.05）。NSCLC患者的癌组织中有血管生成拟态形成,低分化肿瘤较中高分化肿瘤更容易形成血管生成拟态（P<0.01）;Ⅲ期肿瘤较Ⅰ+Ⅱ期肿瘤更容易形成血管生成拟态（P<0.0 1）。血管生成拟态阳性组癌组织中miR-9-5P较血管生成拟态阴性组明显上调。miR-9-5P和血管生成拟态是NSCLC病理差分化的一个指标,两者成正相关。2.miR-9-5P对NSCLC细胞生物学功能的影响与对照组相比,上调miR-9-5P后促进了 A549和H1299细胞的增殖能力,而且随着培养时间延长,差异越明显。上调miR-9-5P后促进了 A549和H1299细胞的克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力和管道形成能力;下调miR-9-5P后结果与上述结果相反。但上调、下调miR-9-5P后A549和H1299细胞均未出现明显的细胞凋亡现象。3.miR-9-5P在NSCLC和血管生成拟态形成中的分子机制生物信息预测E-cadherin是miR-9-5P的潜在靶基因之一,双荧光素酶报告基因实验验证miR-9-5P可直接靶向作用于E-cadherin。Western Blot检测NSCLC肺癌组织中血管生成拟态相关蛋白发现:miR-9-5P上调明显组癌组织中E-cadherin的表达高于上调不明显组、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达低于上调不明显组。Western blot检测A549、H1299细胞株发现:上调miR-9-5P的细胞株E-cadherin蛋白表达量出现明显下降,而MMP2、MMP9、VE-cadherin表达量出现上升,下调miR-9-5P细胞株E-cadherin蛋白表达量出现明显上升,而MMP2、MMP9、VE-cadherin表达量出现下降。4.miR-9-5P对裸鼠NSCLC移植瘤模和移植瘤中血管生成拟态形成的影响裸鼠移植瘤实验发现:与对照组相比,上调、下调miR-9-5P组裸鼠体重增长、成瘤能力无差异;下调miR-9-5P组移植瘤生长速度慢、肿瘤体积小,质量轻;上调miR-9-5P组与对照组相比未见差异。裸鼠移植瘤组织免疫组化、CD31/PAS双染发现:移植瘤肿瘤中有血管生成拟态形成。但因例数少（每组6例）,各组间无差异。免疫组化、Western Blot检测裸鼠移植瘤组织中EMT发生的关键蛋白E-cadherin和血管生成拟态相关蛋白发现:上调miR-9-5P组EMT发生的关键蛋白E-cadherin表达降低;血管生成拟态相关蛋白MMP2、MMP9和VE-cadherin表达升高,下调miR-9-5P组结果与上述结果相反。[结论]1.miR-9-5P、血管生成拟态形成与NSCLC肿瘤分化程度、病理分期等呈负相关,两者之间呈正相关,miR-9-5P上调、血管生成拟态形成可能是临床预后不良的一个指标。2.抑制miR-9-5P能抑制NSCLC的增殖、克隆、迁移、侵袭和管道形成能力,并且能减慢裸鼠移植瘤生长,提示miR-9-5P有可能作为肺癌治疗的一个潜在靶点。3.miR-9-5P降低NSCLC EMT发生的关键蛋白E-cadherin的表达,增加血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达,EMT通路可能是miR-9-5P调节NSCLC生长和血管生成拟态形成的信号通路之一。