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第一部分线粒体靶向纳米粒IR780-NDs的制备及其基本特性检测目的制备一种以脂质体为载体包裹全氟戊烷(perfluoropentane,PFP)、包载七甲川花菁类荧光小分子IR780的脂质纳米粒(IR780-NDs),研究该纳米粒的形态、粒径、电位、包封率及活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生能力。方法采用旋转-乳化法制备IR780-NDs,通过光镜、透射电镜观察纳米粒的大小、形态,Malvern粒径仪检测粒径、电位;通过绘制IR780的标准曲线,计算出IR780-NDs中IR780的包封率;通过单线态氧荧光探针(SOSG)评价活性氧产生能力。结果制备的IR780-NDs水溶液呈淡墨绿色,光镜下大小均一、分散均匀,透射电镜下呈均一圆形;Malvern粒径仪检测出其平均粒径为(354.5±156.3)nm,电位为-(17.95)mV;包封率为82.6%。IR780-NDs经超声辐照后可产生活性氧且产生的量随着IR780-NDs浓度的增加及超声辐照时间的延长而增加。结论本实验成功制备了负载PFP及IR780的脂质纳米粒IR780-NDs,其大小均一呈圆形、均匀分布,经超声辐照后能够产生活性氧。第二部分线粒体靶向纳米粒IR780-NDs多模态成像及体内生物分布实验研究目的研究IR780-NDs体内外荧光(Fluorescent imaging,FL)/光声(Photoacoustic imaging,PA)/超声(ultrasound,US)成像效果,评估其作为多模态造影剂的可行性,观察IR780-NDs的生物分布,评价其在肿瘤组织的优先聚集性;评价IR780-NDs的生物安全性。方法配置2 mg/ml的IR780-NDs溶液与PBS溶液各100μL置于96孔板中,用活体荧光成像仪观察其荧光成像效果;配置不同浓度的IR780-NDs溶液在Vevo Laser光声成像系统中观察其光声成像的效果;配置2 mg/ml的IR780-NDs溶液,经不同强度的超声(0.8 W/cm2、1.6W/cm2、2.4 W/cm2、3.0 W/cm2、4.0 W/cm2)辐照3min;超声诊断仪观察其增强超声成像效果。采集荧光/光声/超声图像后,分析各图像感兴趣区域(region of interest,ROI)的信号强度,评价IR780-NDs体外多模态成像效果。建立裸鼠4T1乳腺癌移植瘤模型,当肿瘤体积增长至大约100 mm3时开始进行体内荧光/光声/超声多模态成像及体内生物分布实验研究。在体内荧光成像实验中,经尾静脉注射IR780-NDs(浓度为3mg/ml),在给药后采集不同时间点(0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h)肿瘤部位荧光图像,24小时后牺牲荷瘤小鼠解离肿瘤组织及重要脏器进行荧光成像。经尾静脉注射Di I标记的NDs及IR780-NDs,24小时后牺牲荷瘤小鼠解离肿瘤组织及重要脏器进行超薄切片,细胞核DAPI染色,荧光显微镜下观察两组纳米粒的体内分布情况。在体内光声成像中,经尾静脉注射IR780-NDs(浓度为3 mg/ml),在给药后采集不同时间点(0 h、1 h、6 h、24 h)进行肿瘤部位光声成像。在体内超声成像中,经尾静脉注射IR780-NDs(浓度为3 mg/ml),在给药后24小时给予超声辐照肿瘤部位,通过超声诊断仪观察肿瘤部位辐照前后超声成像情况。采集荧光/光声/超声/图像后,分析各图像感兴趣区域(region of interest,ROI)的信号强度。随机取25只BALB/c小鼠分为对照组、3 d、7 d、14 d、30 d组(n=5),3 d、7 d、14 d、30 d组经尾静脉注射IR780-NDs(200μL,3.0 mg/m L),给药后3 d、7 d、14 d、30 d采集各组小鼠血液进行血常规及生化指标测定,并解离小鼠重要脏器行病理切片HE染色。结果在体外荧光显像,IR780-NDs组荧光强度明显强于PBS组;体外光声显像中,IR780-NDs光声信号随着其浓度的增加而增强;体外超声超声成像中,IR780-NDs经超声辐照后可以增强超声显影,在辐照强度为2.4 W/cm2时间为3min时成像效果最佳。在4T1乳腺癌移植瘤模型中,体内荧光成像示肿瘤部位的荧光信号强度随着时间的延长而逐渐增强并在给药后24小时达到最大值,肿瘤组织及离体重要脏器荧光成像中,肿瘤组织荧光信号明显强于其他重要脏器。肿瘤组织和重要脏器超薄切片中,IR780-NDs组大量纳米聚集在肿瘤组织中,而在NDs组大量纳米粒聚集在肝脏和脾脏中。体内光声成像同样示,肿瘤部位的光声信号强度随着时间的延长而逐渐增强并在给药后24小时达到最大值;体内超声成像示肿瘤部位经超声辐照后其超声显影明显增强。注射IR780-NDs各组小鼠的血常规、血生化及重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)病理切片HE染色与对照组无明显差异。结论制备的IR780-NDs能够进行体内外荧光/光声/超声多模态成像,能够优先聚集在4T1乳腺癌移植瘤肿瘤组织中且具有良好的生物安全性。第三部分线粒体靶向纳米粒IR780-NDs靶向性及声动力治疗实验研究目的评价IR780-NDs优先聚集于乳腺癌4T1细胞、线粒体靶向能力及在3D肿瘤细胞球的穿透性;评价IR780-NDs胞内ROS产生能力;评价IR780-NDs对乳腺癌细胞及肿瘤的声动力治疗效果及治疗安全性。方法将对数生长期乳腺癌4T1细胞与Di I标记的NDs及IR780-NDs共同孵育(1 h、2 h、3 h、4 h),通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术评价IR780-NDs优先聚集于4T1细胞的能力;将对数生长期乳腺癌4T1细胞与Di I标记的NDs及IR780-NDs共同孵育4 h,以Mito Tracker为线粒体标记,通过激光共聚焦显微镜观察纳米粒线粒体靶向能力;培养3D肿瘤细胞球并与Di I标记的NDs及IR780-NDs共同孵育12 h,通过激光共聚焦显微镜观察纳米粒在3D肿瘤细胞球的穿透情况;将对数生长期乳腺癌4T1细胞分为5组,组I:对照组,组II:单纯超声组;组III:单纯IR780-NDs组;组IV:IR780-NDs+超声组;组V:阳性对照组,各组分别给予不同处理后,以DCFH-DA为ROS探针,评价细胞内ROS产生能力。将对数生长期乳腺癌4T1细胞与不同浓度IR780-NDs(IR780浓度0μg/m L、1μg/m L、2μg/m L、3μg/m L、4μg/m L、5μg/m L)共孵育4h后给予超声辐照不同时间(0 s、30 s、60 s、90 s),给予超声辐照(2.4W/cm2、90 s),通过CCK-8检测4T1细胞存活率;将4T1细胞与不同浓度的IR780-NDs(IR780浓度0μg/m L、1μg/m L、2μg/m L、3μg/m L、4μg/m L、5μg/m L)共孵育4h,给予超声辐照(2.4 W/cm2、90 s),通过流式细胞术检测4T1细胞凋亡情况;将4T1细胞分为4组分别为组I:对照组,组II:单纯超声组;组III:单纯IR780-NDs组;组IV:IR780-NDs+超声组,用钙黄绿素和碘化吡啶行活死细胞染色,通过激光共聚焦显微镜观察4T1细胞存活情况。建立4T1乳腺癌移植瘤模型,待肿瘤体积增长至100 cm3开始给予治疗。将荷瘤裸鼠随机分为4组(n=6),组I:对照组,组II:单纯超声组;组III:单纯IR780-NDs组;组IV:IR780-NDs+超声组。经过不同的治疗,相机隔天拍摄肿瘤大小的改变、测量肿瘤体积、称量裸鼠体重。治疗后各组牺牲一只裸鼠,解离肿瘤组织及重要脏器(心、肝、脾、肺、肾),肿瘤组织进行体重称量及拍照并做病理切片HE染色、TUNEL及PCAN免疫组化染色,重要脏器进行病理切片HE染色。结果激光共聚焦显微镜示4T1细胞与NDs及IR780-NDs共孵育不同时间(1 h、2 h、3 h、4 h)均显示,IR780-NDs组在4T1细胞周围发出的红色荧光(代表纳米粒)明显强于NDs组,且随着时间的延长红色荧光越强。荧光定量分析及流式细胞术同样显示,IR780-NDs组的荧光强度明显高于NDs组,且差异具有有统计学意义(P<0.05)。激光共聚焦显微镜示IR780-NDs组线粒体区域可见大量红色荧光(IR780-NDs),相关系数(PC)=0.87;在NDs组线粒体区域未见明显红色荧光(NDs),相关系数(PC)=0.15。激光共聚焦显微镜示NDs组纳米粒只附着在3D肿瘤球体的表面,IR780-NDs组纳米粒穿透至3D肿瘤细胞球核心并布于整个球体。激光共聚焦显微镜示胞内活性氧检测中阳性对照组绿色荧光强度最高,除此之外,只有在IR780-NDs+超声组出现明显的绿色荧光,其余各组均未见明显绿色荧光。4T1细胞存活率随着IR780-NDs浓度的增加及超声辐照时间的延长而降低。4T1细胞凋亡率随着IR780-NDs浓度的增加而增加。活死细胞染色中对照组均为活细胞无细胞死亡,单纯超声组及单纯IR780-NDs组仅有少量细胞死亡,IR780-NDs+超声组有大量细胞死亡。体内治疗结果显示,超声组、IR780-NDs组肿瘤生长未受到抑制与对照组无明显差异,IR780-NDs+超声组肿瘤生长受到明显抑制与对照组有明显差异,差异具有统计学意义(P<0.05)。各治疗组小鼠体重波动与对照组无明显差异。肿瘤组织病理切片HE染色超声组、IR780-NDs组织中细胞形态与对照组无明显差异,IR780-NDs+超声组多数细胞无完整结构,细胞核形态变化(核固缩、破裂、溶解)。TUNEL及PCNA免疫组化染色结果显示,对照组无凋亡细胞有大量增殖细胞、单纯超声组及单纯IR780-NDs组仅少量凋亡细胞大量增殖细胞,IR780-NDs+超声组大量凋亡细胞仅有少量增殖细胞。结论IR780-NDs可以优先聚集在乳腺癌4T1细胞周围具有良好的线粒体靶向性,能够穿透至3D肿瘤细胞球核心,IR780-NDs能够通过声动力杀伤肿瘤细胞及抑制肿瘤生长且治疗安全性高。