论文部分内容阅读
人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)是引起获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)的病原体。HIV-1属于囊膜病毒。囊膜病毒将其遗传物质释放注入靶细胞,侵染靶细胞只发生在病毒囊膜和靶细胞膜融合之后。囊膜上的融合蛋白主要是介导膜融合过程。我们主要研究的Ⅰ类融合蛋白就是人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的囊膜蛋白。第四代抗HIV病毒的药物,膜融合抑制剂以其高效低毒的特点,能在病毒感染早期阻断病毒入侵细胞。许多基于HIV膜融合这一机制设计的类似抑制剂也处于研究阶段,膜融合抑制剂的代表产品T20不仅价格昂贵,而且一些病毒株已对其产生抗药性。因此,开发新的膜融合抑制剂及寻找新的表达方式尤为重要。HR212可高效抑制HIV,其稳定性好,毒性低,且对一些T20耐受病毒有抑制效果,具有良好的开发前景。根据数据库的信息和软件预测,我们通过对HR212密码子及其mRNA二级结构进行优化,运用改造后的烟草花叶病毒TMV做载体,在烟草本生烟(Nicotiana benthamiana)中进行瞬时表达HR212蛋白,旨在寻求一种低成本、方便、大量生产HR212蛋白的方法。采用农杆菌(Agrobacterium)转化法将目的基因导入植物细胞。我们取HR212基因片段,插入经改造的烟草花叶病毒TMV表达载体,采用电击转化法转化农杆菌GV3101,获得的GV3101-TMV-HR212以侵染本生烟(nicotiana benthamiana)。以绿色荧光蛋白(smGFP)做为报告基因,建立烟草花叶病毒(TMV)瞬时表达体系。采用紫外灯(UV Products, model B1OOAP,365nm)对经过GV3101-TMV-HR212侵染的本生烟进行连续观察,确定该表达体系侵染后的植物外源蛋白聚集表达最大量的时间为7天。利用SDS-PAGE法和免疫印迹法(Western blot法)确定HR212在烟草中成功表达。结果表明本实验成功寻求到了一种低成本、方便、大量生产HR212的方法。应用植物病毒表达载体在烟草中表达了HR212蛋白,本研究为开发低廉的抗HIV的DNA药物提供了理论基础。