前言:胶质瘤是以神经胶质细胞为起源的原发性颅内肿瘤之一。依据WHO（World Health Organization）最新脑胶质瘤的分级标准,将胶质瘤分为少突胶质细胞肿瘤、星形细胞胶质瘤、室管膜胶质瘤、脉络丛肿瘤及胚胎性胶质瘤。有低级别胶质瘤（I、II）和高级别（III、IV）胶质瘤两大类。高级别的胶质瘤恶性程度远远高于低级别胶质瘤。临床上采取多种治疗手段如手术、放疗、化疗或联合治疗等,但是胶质瘤细胞呈浸润性生长,手术难以完全切除,使得胶质瘤成为高复发率、高病死率的颅内最难攻克的肿瘤。寻找有医学转化价值的分子标记物和药物作用靶点并且在加强胶质瘤术前诊断的基础上,探求精准有效的治疗策略是迫在眉睫的研究课题。科学研究认为肿瘤细胞发生行为学变化的分子机制很大程度上是和肿瘤细胞内某种受体唾液酸化密切相关,甚至是由多种受体唾液酸化导致的。异常的唾液酸化致使机体正常细胞发生癌变,并且进一步参与肿瘤细胞的黏附、迁移、侵袭、肿瘤转移、肿瘤细胞产生放疗化疗抵抗等环节。唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素9（Sialic acid binding immunoglobulin like lectins 9即Siglec-9）属于免疫受体超家族的重要成员之一,在各类免疫细胞中广泛表达,能特异性的识别含唾液酸的糖链结构。由于siglec-9与免疫系统密切联系,同时Siglecs家族尤其是Siglec-9在胶质瘤细胞上的研究尚属空白。因此,Siglec-9或许是我们寻找的术前诊断胶质瘤的极其有价值的分子标志物和治疗胶质瘤的作用靶点。Siglec-9或可成为连接胶质瘤化疗和免疫治疗的潜在纽带。因此,我们限定生存分析方法的条件检索中国脑胶质瘤基因组图谱（Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA RNAseq）和美国癌症基因组图谱TCGA RNAseq（The Cancer Genome Atlas）数据库时发现:在各级别的胶质瘤中,只有唾液酸化重要受体Siglec-9具有普遍的预后价值。而这些理论数据在胶质瘤患者的病理切片的免疫组织化学结果中得到印证。Siglec-9的表达量随着胶质瘤病理级别的增高而增加。并且我们发现Siglec-9在高级别胶质瘤的癌旁组织中也有少量表达,这提示我们,Siglec-9或可成为诊断低级别胶质瘤的重要分子。我们进一步的研究结果表明,Siglec-9可促进胶质瘤细胞的增殖和裸鼠皮下植入胶质瘤的生长。以及,Siglec-9极其显著的促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。Siglec-9的不同表达水平影响胶质瘤内黏附蛋白和侵袭相关蛋白的表达。因此,本研究表明:Siglec-9很可能是我们寻找的胶质瘤潜在的临床标记物以及开创胶质瘤免疫治疗的全新切入点。目的:探究Siglec-9对胶质瘤生物学行为的影响;揭示Siglec-9在胶质瘤发展中的作用。方法:1、生物信息学方法:利用CGGA和TCGA两个数据库在GBM中筛选Siglecs家族成员,依据表达量分为高表达以及低表达两组,经由Kaplan-Meier曲线和log-rank检验评估两组间的预后差异。2、细胞培养人脑胶质细胞瘤细胞U-87 MG与U-251 MG使用高糖DMEM+10%FBS+1%青霉素,链霉素双抗的完全培养基在相对湿度90%,5%CO2以及37°C的孵箱中培养。3、过表达Siglec-9稳转细胞系建立以人胶质瘤（GBM）细胞系U87和U251为研究对象,G418筛选稳转Siglec-9质粒使细胞稳定过表达Siglec-9蛋白的稳转细胞株U87 OE,U87 NC和U251 OE,U251 NC以此构建过表达稳转细胞模型组。4、慢病毒敲低Siglec-9细胞系的构建以人胶质细胞瘤GBM细胞系U87和U251为研究对象,慢病毒敲低Siglec-9使细胞低表达Siglec-9蛋白,以此构建敲低组细胞模型。命名为U87 KD,U87 NCV和U251 KD,U251 NCV。5、细胞增殖实验在上述两种细胞模型上分别采用MTS法研究Siglec-9在不同表达水平对两种胶质瘤细胞增殖能力的影响。利用:U87 OE,U87 NC;U251 OE,U251 NC;U87KD,U87 NCV;U251 KD,U251 NCV四组细胞系,在0h,24h,48h,72h,96h时间点加入MTS试剂后分别在490nm测吸光度值,而后将结果在分析软件上作图。6、体外侵袭迁移实验在上述两种细胞模型上分别采用Transwell体外迁移侵袭实验观察Siglec-9对胶质瘤细胞体外迁移侵袭能力的影响。U87 OE,U87 NC;U251 OE,U251 NC;U87 KD,U87 NCV;U251 KD,U251 NCV四组细胞系,培养24小时后,于显微镜下观察、计数与拍照,并进行制图与统计学分析。7、细胞黏附性实验96孔板中每孔加入Matrigel与高糖DMEM的稀释液,超净台中风干,底部形成薄膜。将U87 OE,U87 NC;U251 OE,U251 NC;U87 KD,U87 NCV;U251 KD,U251 NCV接种于上述处理过的96孔板中。甲醇固定后加入结晶紫,再放置摇床用甲醇溶解结晶紫,最后在590nm处测定吸光度,记录数值统计学分析。8、裸鼠成瘤实验在每只裸鼠侧背部皮下注射过表达Siglec-9的肿瘤细胞或未过表达Siglec-9的肿瘤细胞悬液100μl（5×106细胞）使裸鼠成瘤,定期观察裸鼠成瘤情况并记录。观察6周后处死裸鼠,取出瘤块测量其长径,由此来揭示Siglec-9对胶质瘤发生、发展的作用9、蛋白免疫印迹（western blot）（1）细胞组织蛋白:利用蛋白免疫印迹（western blot）分别检测上述两种细胞模型中即研究Siglec-9不同表达水平时对胶质瘤细胞内相关重要蛋白如,黏着斑激酶FAK;基质金属蛋白酶MMP9、MMP7和MMP2;增殖细胞核抗原PCNA;细胞间黏附分子-1即ICAM-1共6种蛋白表达的影响,进一步阐明Siglec-9对不同级别胶质瘤细胞的影响。（2）肿瘤组织蛋白:利用蛋白免疫印迹（western blot）分别检测IV级胶质瘤、III级胶质瘤、II级胶质瘤、颅内转移癌、良性肿瘤及癌周组织总蛋白中Siglec-9的表达水平。10、免疫组织化学方法利用免疫组织化学方法直观表现不同病理级别的胶质瘤细胞,如低级别的Ⅱ级胶质瘤细胞和高级别Ⅲ级,或Ⅳ级胶质母细胞瘤以及相对应的癌旁组织中Siglec-9表达情况,更深一步表明Siglec-9和胶质瘤细胞的发生发展以及生物行为学改变密切相关。11、统计分析t检验适用于组间差异,q检测用于各组均数间两两比较,Kaplan-Meier法用于生存分析;所有数据由至少三次实验结果得到的均数±标准差表示。分析工具SPSS 20.0和Graph Pad Prism5软件统计分析,双尾P<0.05为实验结果有统计学意义的判定标准。结果:1、CGGA和TCGA数据显示Siglec-9在胶质瘤中高表达,具有显著的预后价值不论是CGGA还是TCGA数据库,Siglec-9的表达量显著影响胶质瘤患者的生存时间。Siglec-9在各病理级别胶质瘤中高表达且表达量和胶质瘤的病理级别数正相关。2、Siglec-9在胶质瘤临床标本中高表达（1）免疫组织化学结果:Siglec-9在胶质瘤组织中的染色明显高于癌旁组织的染色。并且胶质瘤级别越高,染色越深。（2）蛋白免疫印迹结果:Siglec-9在高级别胶质瘤组织中高表达,低级别胶质瘤低表达,在颅内转移癌组织和良性肿瘤内高表达。3、Siglec-9的表达调控胶质瘤细胞的增殖通过慢病毒介导的包装转染,建立胶质瘤U87和U251过表达（OE）和干扰（KD）Siglec9的细胞模型,MTS实验结果显示:过表达Siglec-9组（U87 OE）与对照组（U87 NC）相比细胞增殖能力显著提高。而干扰Siglec-9组（U87 KD）和对照组（U87 NCV）相比细胞增殖能力显著降低。同样,在U251细胞系中U251 OE组比U251 NC细胞增殖能力提高,U251 KD和U251 NCV组相比细胞增殖能力下降。4、Siglec-9增强胶质瘤的体外侵袭迁移能力U87细胞的迁移小室体外侵袭和迁移实验结果说明,过表达Siglec-9组（U87 OE）细胞穿过纤维素膜孔的细胞数目明显多于对应的对照组（U87 NC）;而干扰掉细胞内的Siglec-9时,实验组（U87 KD）中穿过纤维素膜孔的肿瘤细胞数目明显小于相应的对照组（U87 NCV）的细胞数目。5、Siglec-9提高胶质瘤细胞的黏附能力过表达Siglec-9的U87细胞（U87 OE）的黏附性明显强于对照组（U87 NC）,敲低Siglec-9的U87细胞（U87 KD）后与对应的对照组（U87 NCV）相比细胞的OD值明显下降。过表达Siglec9的U251细胞（U251 OE）的黏附性明显强于对照组（U251 NC）,敲低Siglec9的U251细胞（U251 KD）后与对应的对照组（U251 NCV）相比细胞的OD值明显下降。四组实验说明,Siglec-9可提高胶质瘤细胞的黏附能力。6、Siglec-9影响胶质瘤细胞内相关蛋白的表达水平利用U87和U251细胞系,分别在过表达Siglec9和沉默Siglec9的条件下,检测表征胶质瘤恶化程度的6种相关重要蛋白的表达情况。蛋白免疫印迹实验结果表明,在U251细胞中过表达Siglec-9发现PCNA和MMP7表达水平比对照组相应表达水平略微上升。在U251细胞中沉默Siglec9时MMP9显著下降。在U87细胞中过表达Siglec-9时FAK、ICAM、MMP2、MMP9、MMP7和PCNA共6种蛋白的表达水平与相应的实验组比较,表达水平均明显提高;而U87细胞中干扰Siglec-9使其在肿瘤细胞内表达下降时,我们发现6种蛋白的表达和対照度相比有相应的下降。7、过表达Siglec-9促进裸鼠成瘤与对照组相比,Siglec-9过表达组的皮下移植瘤直径和体积明显偏大。待观察结束,解剖裸鼠取出胶质瘤测量的结果与前述一致。结论:1、Siglec-9在不同级别的胶质瘤中呈差异性高表达,其表达量与胶质瘤的恶性程度正相关。2、Siglec-9可低幅度促进胶质瘤细胞的增殖,但显著提高胶质瘤细胞的体外迁移、侵袭及黏附能力,显著促进胶质瘤的生长。3、Siglec-9可显著影响胶质瘤的多项生物学行为,或可成为胶质瘤的生物标记物和免疫治疗的作用靶点。