前言:喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一,在我国东北地区高发,且发病率呈逐年上升趋势。喉癌早期症状不明显,超过半数的喉癌患者确诊时已经发展到中晚期,并存在不同程度的浸润和淋巴转移。喉癌的复发和转移是影响喉癌患者五年生存率的重要因素。目前,喉癌的治疗仍以手术和放疗为主,缺乏早期诊疗和预后判断的分子标志物。因此,深入研究喉癌发生发展的分子机制将有利于发现喉癌诊断和治疗的分子靶标,具有潜在的临床价值。肿瘤异质性是恶性肿瘤的特征之一,即肿瘤组织由表达谱或生物学功能不同的细胞亚群组成,致使肿瘤的生长速度、侵袭转移能力及对药物的敏感性等各方面产生差异,是肿瘤复发、转移和耐药的主要原因,直接影响临床治疗效果。因此,分析肿瘤异质性具有潜在的临床诊断价值,深入研究肿瘤异质性的形成及调控机制将为肿瘤的精准靶向治疗提供理论依据。目前,肿瘤异质性的形成原因存在两种学说,即克隆选择学说与肿瘤干细胞学说。克隆选择学说认为肿瘤异质性起源于单个肿瘤细胞群在发展中继续突变,适合存活的细胞群被保留下来造成肿瘤异质性;肿瘤干细胞学说认为肿瘤是由一小群具有自我更新能力的肿瘤干细胞（Cancer stem cell,CSC）及其分化程度不均的细胞团组成,从而肿瘤表现出异质性。但两种学说都支持肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）对肿瘤异质性的形成起着举足轻重的作用。肿瘤微环境是指肿瘤细胞发生和发展的内环境,其中不仅包括肿瘤细胞本身,还有与肿瘤细胞密切联系的免疫细胞和基质细胞,同时也包括附近区域内的细胞间质、微血管以及浸润于其中的生物分子。近年,基于肿瘤微环境的个体化治疗越来越受到重视,特别是肺癌、卵巢癌、胰腺癌等免疫治疗已广泛应用于临床,且患者的生存质量和五年生存率均获益很大。然而,人们对喉癌的肿瘤微环境仍知之甚少。因此,深入了解喉癌肿瘤微环境的细胞组成、喉癌细胞与微环境中各细胞的相互作用和喉癌细胞对微环境的影响,将有利于发现喉癌发生发展的生物标志物和潜在的治疗靶点,为喉癌的分子诊断、防治和预后判断提供理论基础。随着单细胞测序技术的迅速发展,研究者们可在单细胞水平层面研究生物进程和一些疾病的发生发展,广泛应用于肿瘤、发育生物学、临床诊断及干细胞发育及分化等领域,是目前研究的焦点。肿瘤单细胞测序能够在单个细胞水平上研究肿瘤的异质性、肿瘤微环境、追踪癌细胞的转移和扩散以及了解癌症治疗过程中癌细胞的耐药性演变等,为探索恶性肿瘤的临床诊疗和预后判断等提供新方法和新思路。因此,本研究中我们拟通过喉癌单细胞测序进行以下研究:1)分析喉癌和喉癌微环境的异质性,绘制喉癌单细胞图谱;2)分析各组织的细胞组成差异,发现与喉癌侵袭转移密切相关的恶性细胞亚群;3)分析上皮源性细胞的拷贝数变异、恶性得分、差异活化转录因子和信号通路,初步探讨导致恶性肿瘤细胞异质性的机制和调控喉癌侵袭转移的关键调控因子;4)分析免疫细胞各亚群的功能和活化的信号通路、发育轨迹、关键转录因子,初步揭示喉癌细胞免疫逃逸的机制。材料与方法:1、实验材料:人喉癌组织（Tumor,T）、边缘癌组织（Regions Tumor,R）、正常上皮组织（Normal Tissue,N）和淋巴结转移癌组织（Lymphoid Tissue,L）标本,人喉癌细胞系。2、实验方法:制备单细胞悬液、10×Genomics细胞标记和逆转录、c DNA文库构建及扩增、二代测序、测序数据预处理和归一化、细胞周期效应评估、多样本整合分析、PCA降维、tSNE细胞聚类和可视化、Infer CNV和sc Cancer分析上皮源性细胞亚群的拷贝数变异和良恶性、Single R细胞类型注释、细胞亚群拟时序分析、GSEA功能和信号通路富集分析、SCENIC转录因子预测分析、免疫荧光实验、细胞培养、基因转染、Real-time PCR、Western Blot、染色质免疫沉淀技术、双荧光素酶报告基因活性检测、Transwell实验。结果:1、单细胞测序与分析质控结果毛细管电泳实验检测结果显示样本c DNA及c DNA文库质量均符合二代测序标准。Cell Ranger软件输出结果显示,单细胞测序结果质控合格,细胞周期效应对细胞分群聚类影响不大,提示测序数据可以进行后续的生物信息学分析。2、喉癌微环境异质性分析tSNE细胞亚群聚类分析结果显示,喉癌组织中共存在25个亚群;Single R细胞亚群注释和组织免疫荧光实验显示,喉癌微环境中存在上皮源性细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、NK细胞、内皮细胞和成纤维细胞7大类组成;其中,上皮源性细胞和免疫细胞数量较多且存在多个细胞亚群,具有复杂的异质性,而基质细胞数量较少且都只有一个亚群。这些结果提示喉癌具有复杂的异质性,上皮源性细胞和免疫细胞的异质性是喉癌异质性的主要原因。3、上皮源性细胞异质性与喉癌侵袭转移的关系上皮源性细胞亚群tSNE再聚类结果显示,上皮源性细胞存在12个亚群,其中正常上皮组织中主要为C0、C1、C2,淋巴组织中主要为C4、C5、C6、C7,肿瘤组织中主要为C2、C6、C8、C9、C11,边缘肿瘤组织主要为C0、C1、C3、C10、C4、C5;GSEA功能富集和拟时序分析结果显示,5个亚群（C0、C2、C7、C9和C10）细胞角化较好,其中C2和C9处于角质分化末端;2个亚群（C1和C3）EMT功能显著增强;3个亚群（C6、C8和C11）具有IFN-ɑ应答和中性粒细胞趋化作用,且三者均处于发育早期;2个亚群（C4和C5）增殖能力较强,处于增殖分化末端。这些结果提示C6、C8和C11亚群与喉癌侵袭转移密切相关,C4和C5与喉癌细胞恶性增殖相关。4、免疫细胞异质性与喉癌侵袭转移的关系4.1 T/NK细胞亚群与喉癌侵袭转移的关系T/NK细胞亚群tSNE聚类和Single R注释结果显示,T/NK细胞存在11个细胞亚群,包括1个naive CD4+T细胞亚群、2个Tregs细胞亚群、2个CD4+记忆T细胞亚群,2个CD8+T细胞亚群、1个NK细胞亚群、1个CMP细胞亚群和1个γδT细胞亚群。其中,肿瘤组织浸润的T/NK细胞亚群最多,以Tregs细胞和γδT细胞为主;肿瘤边缘组织Tregs细胞、CD8+T细胞和γδT细胞为主;正常黏膜组织中CD8+T细胞、NK细胞和CMP细胞为主;淋巴转移癌组织中CD4+记忆T细胞、naive CD4+T细胞和Tregs细胞为主。GSEA功能富集分析结果显示,CD8+T细胞细胞毒性、抗原结合及趋化作用等功能显著激活;CD4+记忆T细胞翻译相关功能显著活化;Tregs细胞肿瘤坏死因子及其受体、自噬、凋亡等功能显著激活;NK细胞细胞毒性、抗原结合及外分泌等功能显著激活;γδT细胞氧化还原反应、染色体构象改变及细胞毒性等功能显著激活。拟时序分析结果显示,各细胞亚群中存在处于发育各个阶段的细胞。这些结果提示喉癌组织中表现出T细胞免疫抑制的状态,边缘喉癌组织中浸润了较多的具有免疫杀伤性的T细胞,淋巴转移癌组织中T细胞处于幼稚状态。4.2 B细胞亚群与喉癌侵袭转移的关系tSNE亚群聚类和Single R注释结果显示,B细胞存在9个细胞亚群,包括5个naive B细胞亚群、2个浆细胞亚群、1个记忆B细胞亚群和1个生发中心B细胞亚群。大部分B细胞位于淋巴组织中,肿瘤组织中存在少量的浸润。GSEA功能富集和拟时序分析结果显示,生发中心B细胞增殖功能增强,处于增殖分化末端;浆细胞部分亚群未折叠蛋白反应显著活化,且处于幼稚阶段;记忆B细胞启动了对抗原的再次刺激进行应答,但还未出现大量增殖和分化;naive B细胞亚群分别处于免疫应答的不同阶段。这些结果提示部分B细胞处于发育早期,部分发生功能异常,抗肿瘤免疫作用甚微。4.3髓系细胞亚群与喉癌侵袭转移的关系tSNE亚群聚类和Single R注释结果显示,髓系细胞存在7个细胞亚群,包括3个单核细胞亚群,2个巨噬细胞亚群,1个中性粒细胞亚群和1个树突状细胞亚群。T组织中巨噬细胞亚群占比最高;R组织中中性粒细胞亚群占比最高;N组织中单核细胞和巨噬细胞占比最高;L组织中树突状细胞亚群占比最高,并存在少量中性粒细胞。GSEA功能富集和拟时序分析结果显示,巨噬细胞C0亚群和单核细胞亚群调控B细胞增殖和分化功能显著上调,调控T细胞分化的功能显著下调,而巨噬细胞C3亚群增殖能力显著上调,发育轨迹无特异性,存在多个发育阶段的细胞;中性粒细胞促血管生成和抗菌免疫应答功能显著活化,存在发育早期和促炎反应功能分化末端两种状态;树突状细胞调控T细胞分化功能显著上调,大部分细胞处于发育早期。这些结果提示喉癌中巨噬细胞发挥着重要作用,中性粒细胞参与喉癌炎症微环境的形成,与喉癌的侵袭转移密切相关。5、基质细胞功能分析GSEA功能富集分析结果显示,成纤维细胞自噬、蛋白酶体介导的蛋白降解等功能显著活化;内皮细胞自噬、中性粒细胞功能调控等功能显著活化。成纤维细胞无组织特异性;内皮细胞主要存在于正常黏膜上皮组织中。提示基质细胞对喉癌侵袭转移的影响较小。6、细胞间通讯网络分析基于配体-受体的细胞间互作分析结果显示,上皮源性细胞与成纤维细胞配对数目最多,髓系细胞次之;配体-受体特异性分析结果显示,上皮源性细胞与成纤维细胞相互作用最为特异。上述结果提示上皮源性细胞与成纤维细胞互作较为密切,而与T淋巴细胞和B淋巴细胞互作较少。7、上皮源性细胞异质性形成机制研究7.1上皮源性细胞拷贝数变异及良恶性分析拷贝数变异分析结果显示,喉癌组织中位于3p、6q、7q、11q、12q的基因出现大量扩增,而位于3q、5p、5q、13p、13q的基因出现大量缺失;边缘癌组织与癌组织相似,但是基因扩增和缺失程度降低,边缘癌组织中细胞的8号染色体基因明显扩增,13号染色体基因明显缺失;正常组织中也存在部分染色体区域的拷贝数变异;淋巴组织中的肿瘤细胞存在广泛的不规律的基因扩增和缺失。应用sc Cancer分析结果显示,上皮源性细胞转录组的恶性得分存在2组得分峰值,即恶性和良性细胞。T组和R组大部分为恶性细胞,N组主要是良性细胞,与病理检测结果一致。这些结果提示喉癌中上皮源性细胞存在复杂的拷贝数变异,是异质性形成的原因之一。7.2调控上皮源性细胞异质性的关键通路及转录因子分析GSEA通路富集分析结果显示,NOTCH通路在调控细胞侵袭转移中发挥重要作用;转移至淋巴组织的恶性细胞主要依赖氧化磷酸化获能,且增殖旺盛;NFκB通路在上皮细胞出现免疫特性及转移中发挥重要作用。转录因子富集分析结果显示,RAD21、BRCA1、ETS1等转录因子在喉癌细胞增殖过程中起重要作用;SOX2、SOX4、HOXC9、YY1等转录因子在喉癌细胞干性和转移过程中具有重要作用;FOSL1、PITX1在喉癌细胞角化过程中发挥重要作用。这些结果提示EMT、IFNɑ应答、NOTCH和NFκB通路在喉癌侵袭转移中发挥着重要的作用。7.3 YY1/C-MYC/HMGB1信号轴对喉癌侵袭转移的影响及分子机制研究TCGA数据库中YY1和HMGB1在头颈部鳞癌中表达水平统计分析结果显示,YY1和HMGB1在头颈部鳞癌中均显著上调,且呈正相关关系（P<0.05）;二者表达水平升高与头颈部鳞癌淋巴结转移密切相关（P<0.05）。YY1下游靶基因分析结果显示,C-MYC是YY1的下游直接靶基因;二者表达水平在头颈部鳞癌中呈正相关关系（P<0.05）;在喉癌中敲减YY1能够显著降低C-MYC表达水平（P<0.05）。上述结果提示在喉癌中YY1能够转录激活C-MYC表达,并促进C-MYC下游基因HMGB1的表达水平。生物信息学预测结果显示,HMGB1是C-MYC的下游靶基因;二者表达水平在头颈部鳞癌中呈正相关关系（P<0.05）;在喉癌细胞中,转染C-MYC过表达和敲减载体后,HMGB1表达水平显著升高和降低（P<0.05）;双荧光素酶报告基因活性检测结果显示,过表达C-MYC能够显著增高HMGB1启动子活性（P<0.05）;Ch IP实验结果显示,C-MYC能够与HMGB1启动子区结合。上述结果提示C-MYC能够直接转录激活HMGB1表达。Transwell实验结果显示,C-MYC过表达和敲减分别促进和抑制喉癌细胞迁移能力（P<0.05）;敲减HMGB1细胞迁移能力显著降低（P<0.05）;敲减HMGB1能够显著回复C-MYC过表达对细胞迁移能力的促进作用。上述结果提示C-MYC可以通过HMGB1促进喉癌细胞迁移。8、免疫微环境异质性形成机制的初步分析T/NK细胞GSEA通路富集和转录因子分析结果显示,TNF-β信号通路在调控细胞毒性作用中发挥重要作用,JAK-STAT信号通路在调控Treg细胞活性中发挥着重要作用。转录因子ETS1、TAF7、EOMES等在CD8+T细胞和γδT细胞中发挥着重要作用;REL、FOXP3、ETS1等在Treg细胞中发挥着重要作用;而CD4+记忆T细胞和naive CD4+T细胞中转录因子得分均较低。B细胞GSEA通路富集分析结果显示,谷胱甘肽代谢在幼稚B细胞中显著上调;浆细胞氧化磷酸化通路显著下调。转录因子分析结果显示,幼稚B细胞和记忆B细胞中,C0、C1、C2、C8亚群中FOXP1、HES1、ETS1等得分较高,C3亚群中MAFB、RELB、NFKB1等得分较高;浆细胞中IRF4、ETS2、XBP1等得分较高;生发中心B细胞中RAD21、REL等得分相对较高。髓系细胞GSEA通路富集分析结果显示,巨噬细胞中氧化磷酸化、DNA复制等信号通路显著活化;单核细胞中TNF和MAPK信号通路显著活化;中性粒细胞中RIG-1样受体通路显著活化;树突状细胞中RIG-1样受体通路及T细胞受体等信号通路显著活化。转录因子分析结果显示,巨噬细胞中E2F1和BRCA1促进C3亚群增殖,MAF、SPI1和STAT1促进C0亚群吞噬功能;单核细胞中POU2F2、MEF2C和SPIB促进C2和C7细胞亚群TNF和MAPK通路的活化,并促进其将抗原提呈给B细胞;CREM、FOXO3、XBP1、KLF3和BRCA1促进C5亚群吞噬活性。这些结果提示我们,转录因子的差异表达和关键信号通路的差异活化是肿瘤免疫微环境异质性形成的潜在机制,值得我们深入研究。结论:1、喉癌具有复杂的微环境,主要由上皮源性细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、NK细胞、内皮细胞和肿瘤相关纤维细胞7大类组成。上皮源性细胞和免疫细胞的异质性是喉癌异质性的主要原因。2、喉癌细胞存在多个细胞亚群,其中C6、C8和C11亚群与喉癌侵袭转移密切相关,C4和C5与喉癌细胞恶性增殖相关,转移至淋巴组织的肿瘤细胞增殖能力显著增强。3、喉癌组织中表现出免疫抑制的状态;喉癌边缘组织表现出炎症微环境的状态;淋巴转移癌组织中存在大量的记忆性T细胞和记忆性B细胞,但未出现免疫应答。4、上皮源性细胞与成纤维细胞及髓系细胞联系较为密切,与T淋巴细胞和B淋巴细胞互作较少。5、上皮源性细胞存在复杂的拷贝数变异,是异质性形成的原因之一。6、存在包括NF-κB和NOTCH在内的多个信号通路和转录因子参与喉癌细胞异质性的形成和侵袭转移的调控。7、在喉癌中,转录因子YY1能够转录激活C-MYC表达;C-MYC能够直接转录激活HMGB1表达,促进喉癌细胞迁移。8、存在多个信号通路和转录因子参与喉癌免疫微环境异质性的形成,具有复杂的基因调控网络。