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目的:
探讨含有胰岛素样生长因子-1(IGF-I)的丝素-壳聚糖支架(Silk fibroin-chitosanscaffold)对大鼠颌下腺细胞(Rat submandibular gland cells RSGCs)粘附、增殖、分泌作用的影响,为进一步构建功能性的颌下腺组织提供依据。
方法:
体外组织块法原代培养1-3天龄Wistar大鼠的颌下腺细胞,免疫组织化学法鉴定、胰酶消化法和差速贴壁法纯化、传代扩增。
采用冻干技术制作含有IGF-I的丝素-壳聚糖支架用作实验组,不含IGF-I的丝素-壳聚糖支架用作对照组。支架的规格统一为5mm×5mm×5mm,其中用作实验组的每个支架含IGF-I浓度为10ng/ml。
将浓度为5.0×106/ml的第二代大鼠颌下腺细胞悬浊液接种于含有IGF-I的丝素-壳聚糖支架为实验组进行培养;将浓度为5.0×106/ml的第二代大鼠颌下腺细胞悬浊液接种子不含IGF-I的丝素-壳聚糖支架为对照组进行培养。
于接种后的2h、4h、8h、12h、24h测定实验组和对照组的大鼠颌下腺细胞的粘附率,免疫荧光观察细胞在支架上的粘附情况。MTT法检测接种后1d、3d、5d、7d、9d实验组和对照组的大鼠颌下腺细胞增殖情况。扫描电镜观察接种后1d、3d、5d大鼠颌下腺细胞在支架上生长的超微结构。测定1d-9d培养复合物上清液中淀粉酶含量,检测实验组和对照组的大鼠颌下腺细胞分泌功能。采用SPSS forwindows13.0统计分析软件对结果进行方差分析,检验水准α=0.05,P<0.05有统计学意义。
结果:
1、成功将纯化扩增的大鼠颌下腺细胞与含IGF-I的丝素-壳聚糖支架和不含IGF-I的丝素-壳聚糖支架复合培养。
2、细胞粘附率检测:实验组粘附率高于对照组,2h、24h时P>0.05;4h、8h、12h时P<0.05。
3、免疫荧光检测:Hoechst染色观察,RSGCs与支架复合培养2h,实验组支架上可见细胞蓝色荧光,对照组偶见;24h时两组支架上布满蓝色细胞荧光,实验组略多于对照组。
4、细胞增殖结果显示(MTT法):接种后1d,实验组细胞数量略大于对照组(P>0.05),而3d-9d,两组支架上的细胞数量有显著性差异(P<0.05),实验组优于对照组。
5、细胞上清液中淀粉酶含量检测:两组大鼠颌下腺细胞上清液的淀粉酶分泌量均有不同程度的增加,从3d-9d实验组优于对照组,淀粉酶含量差异有统计学意义(P<0.05)。
6、扫描电子显微镜观察:丝素-壳聚糖支架呈海绵状结构,植入初期大鼠颌下腺细胞成圆形,散在的粘附于丝素-壳聚糖支架网孔内,实验组突起较少,对照组几乎没有突起;随着时间的延长,实验组大鼠颌下腺细胞呈多角形、带有多个突起,细胞表面凹凸不平,对照组突起和细胞表面凸凹不平没有实验组明显。
结论:
含IGF-I的丝素-壳聚糖支架对大鼠的颌下腺细胞的粘附、增殖、分泌均有促进作用。