目的:　　1、采用基因敲除技术敲除大肠杆菌基因组上对砷的“外排泵”基因，构建敏感菌株;　　2、采用基因融合技术构建对砷敏感、特异检测的质粒型报告菌株，并建立一套稳定、灵敏、准确的检测条件，为荧光报告菌株应用于检测各类水体环境中类金属砷奠定基础;　　3、采用基因敲入技术，构建对砷敏感、特异的基因组型报告菌株。　　方法:　　1、构建超敏感菌株　　采用基因敲除技术构建对砷离子敏感的菌株。　　2、构建质粒型报告菌株　　利用交叉PCR技术将筛选到的砷离子特异性的调节蛋白基因arsR、源于E.coli基因组的启动子ars与增强型绿色荧光蛋白基因egfp分别进行基因融合，构建包含/不包含调节蛋白基因的类金属砷检测元件。进行无缝克隆，构建相应质粒报告菌株，筛选出对照组ars-arsR-egfp-pET28b/E.coli MC4100、实验组ars-arsR-egfp-pET28b/arsB-，并将菌株命名为WMC0011-A、WMC0011-B。　　3、质粒型报告菌株WMC0011-B性能测定和条件优化　　对构建的报告菌株进行测定条件优化及相关参数确定，以建立一套特异、稳定、灵敏的检测条件，包括培养基的优化实验、反应曲线的测定、诱导动力学实验、特异性与干扰性实验、最适检测线性范围的确定、最低检测限的测定等内容。　　4、构建基因组型报告菌株　　4.1 构建打靶载体　　采用交叉PCR技术将ars-arsR-egfp基因的编码框序列分别与大肠杆菌araB基因两端约500 bp的同源臂进行融合，构建类金属砷检测元件。进行T-A克隆，测序比对无误后，克隆到pKOV质粒SalⅠ和NotⅠ双酶切位点中，构建打靶载体:araB-N-ars-arsR-egfp-araB-C-pKOV。　　4.2 采用基因敲入技术构建报告菌株　　pKOV为低拷贝质粒，其包含一个温度敏感的PSC101复制起始子-repAts、氯霉素抗性基因-cat和枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因-sacB(该基因的表达可使其宿主菌在高浓度蔗糖环境中无法生长而致死)。　　基因敲入的步骤:(1)将以上成功构建的打靶载体转入到超级感受态E.coliDH5α，并涂布于20μg/ml Cmr/LB平板，挑取阳性克隆，提取质粒araB-N-ars-arsR-egfp-araB-C-pKOV，将其转化到E.coli MC4100菌株和arsB-感受态细胞中，并涂布于LB/Cmr平板，置30℃培养12h;(2)第一步同源重组:利用pKOV对温度敏感的特性，将其置于43℃摇床振荡培养2h，再涂布于Cmr/LB平板43℃孵育，挑取成功连接在基因组阳性克隆;(3)第二步同源重组:利用pKOV在高浓度的蔗糖环境无法生长而致死的特性，将第一步同源重组阳性克隆于5％蔗糖LB液体培养基中30℃摇床振荡培养2h，将其涂布于5％蔗糖LB平板，挑取在5％蔗糖LB平板生长的菌落，次划线接种于一个Cmr/LB平板和5％蔗糖LB平板上挑取只在5％蔗糖LB平板上生长的菌落进行PCR鉴定。阳性克隆打靶载体将发生第二次同源重组，pKOV质粒将丢失，砷检测元件成功置换到E.coli MC4100和arsB-突变菌株的araB位置。并将菌株命名为WMC0011-C/WMC0011-R。　　5、WMC0011-R性能的测定和优化　　对构建的WMC0011-R进行测定条件的优化及相关参数确定，以建立一套特异、灵敏的检测条件。　　结果:　　1、构建超敏感菌株　　1.1 采用Red重组酶系统原理的基因敲除技术，成功构建出对类金属砷敏感的大肠杆菌基因缺失菌株arsB-。　　1.2 菌株arsB-对砷离子敏感性的测定　　生长曲线结果显示，arsB-在LB/M9/HMM液体培养基中的生长曲线趋势与E.coli MC4100相一致，说明基因arsB敲除后对其生长状态基本无影响，培养基也无影响;　　最低抑菌浓度实验结果显示，相对于E.coli MC4100，arsB-在LB和HMM培养基中，对As3+的敏感性均显著增加;LB培养基中，其敏感程度为野生型的39倍，HMM培养基中，其敏感程度为野生型的32倍，在M9培养基中，其敏感程度为野生型的16倍，故不选用M9培养基做后续实验。　　2、构建质粒型报告菌株　　2.1 构建含有启动子和绿色荧光蛋白基因质粒报告菌株　　为了降低其荧光本底值，对特异性启动子和荧光蛋白筛选，并采用基因融合和菌落PCR技术成功筛选到目的菌株ars-egfp-pET28b/arsB-，但是在不同浓度As3+诱导下，荧光值很低，说明该菌株检测As3+的能力差，需重新更改方案;　　2.2 构建含有启动子、调节蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的质粒报告菌株　　通过对特异性启动子、调节蛋白基因和荧光蛋白的筛选，并采用基因融合和菌落PCR技术成功筛选到目的菌株ars-arsR-egfp-pET28b/arsB-和对照菌株ars-arsR-egfp-pET28b/MC4100，在不同浓度As3+诱导下，在发射波长511.2 nm处有吸收峰值，说明该菌株具备检测As3+的能力;　　由于本课题需要构建最优性能菌株，在研究上述构建的报告菌株性能时，发现ars-arsR-egfp-pET28b/arsB-相对于其它菌株，在相同条件下，具有特异性好、灵敏度高等特点，因此本课题选择该菌株，命名为E.coli WMC0011-B;　　3、质粒型报告菌株WMC0011-B性能测定和条件优化　　3.1 LB培养基中条件优化　　孵育OD600和时间结果显示，WMC0011-B表达EGFP的诱导动力学曲线趋势和其生长曲线趋势基本一致，与As3+孵育的0-7 h内，最佳孵育OD600值为0.3，最佳孵育时间为4h;　　特异性、选择性实验结果显示，WMC0011-B对As3+特异性好、选择性强，能耐受pb2+、Hg2+、Cu2+、Mg2+、Cd2+、Zn2+、Fe3+和Ni2+等常见金属的干扰;　　曲线拟合实验结果显示，WMC0011-B的线性范围为1×10-8-4.27×10-5 mol/L，在此As3+浓度范围内，有较高线性范围拟合度和灵敏度，EGFP的表达量荧光强度与As3+浓度呈现剂量依赖关系，对As3+的最低检测限达到国家检测标准;　　加标回收实验结果表明，在含有40 mM MOPS缓冲成分的LB培养基中，WMC0011-B对pH为1.00～14.00的样品和实际样品中As3+的加标回收率效果较好。　　3.2 HMM培养基中条件优化　　孵育OD600和时间结果显示，WMC0011-B表达EGFP的诱导动力学曲线趋势与其生长曲线趋势基本一致，与As3+孵育的0-4 h内，最佳孵育OD600值为0.1，最佳孵育时间为2.5 h;　　特异性、选择性实验结果显示，HMM培养基中，WMC0011-B对As3+特异性好、选择性强，能耐受pb2+、Hg2+、Cu2+等常见金属离子的干扰。　　4、构建基因组型报告菌株　　为了克服质粒菌株报告检测的的不稳定性以及降低其荧光本底值，采用基因融合和基因敲入等成功筛选到敲入araB基因位置的目的菌株pBAD/ars-arsR-egfp-araB-arsB-和对照菌株pBAD/ars-arsR-egfp-araB-，命名为WMC0011-R和WMC0011-C。　　5、WMC0011-R性能的测定和优化　　5.1 生长曲线结果显示，pBAD/ars-arsR-egfp-araB-和pB AD/ars-arsR-egfp-araB-arsB-在LB、HMM液体培养基中的生长曲线趋势与E.coli MC4100相一致，说明基因arsB和araB敲除后对其生长状态基本无影响;　　5.2 最低抑菌浓度实验结果显示，相对于E.coli MC4100和pBAD/ars-arsR-egfp-araB，pBAD/ars-arsR-egfp-araB-arsB-在LB培养基和HMM培养基中，对As3+的敏感性均有一定程度的增加，与突变菌arsB-相一致;　　5.3 本底荧光检测结果显示，质粒型报告菌株的荧光本底值为基因组型的8.45倍，因此，基因组型报告菌株的本底值低;　　5.4 孵育OD600、时间结果显示，LB/HMM培养基中，与As3+孵育的0-5 h内，最佳孵育OD600值分别为0.02/0.05，最佳孵育时间分别为4h/2.5 h;　　5.5 特异性和干扰性实验结果显示，LB/HMM培养基中，基因组报告菌株pBAD/ars-arsR-egfp-araB-arsB-对As3+特异性好、选择性强，与质粒型报告菌株相一致;　　5.6 曲线拟合实验结果显示，LB/HMM培养基中，基因组报告菌株的线性范围为0.05-3.2×10-5mol/L和0.05-1.6×10-5mol/L，在此浓度范围内，对As3+均有较高线性范围拟合度和灵敏度，线性范围与质粒型报告菌株相一致。　　结论:　　本课题成功建立了一种特异和敏感检测地表水体中砷离子的质粒型生物荧光检测菌株，同时熟练掌握大肠杆菌的基因敲除与基因敲入技术，并对构建的质粒报告菌株、基因组报告菌株进行了测定条件的优化及相关参数确定，以确立一套特异、稳定、敏感的实验检测条件，为生活饮用水和工业废水等地表水体中的砷检测奠定基础，具备检测地表水体中砷的应用前景。