肠膜明串珠菌(Leuconostoc. mesenteroide)葡聚糖蔗糖酶基因的克隆与表达

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葡聚糖蔗糖酶(Glucansucrase),亦称蔗糖-6-葡萄糖基转移酶)(EC.2.4.5.1),是一种糖苷转移酶。它以蔗糖为底物,将蔗糖中葡萄糖基聚合成高分子量的葡聚糖,同时释放出果糖。在有受体存在的情况下,形成低分子量寡聚糖。葡聚糖蔗糖酶可以直接加入发酵食品中改变产品的质地,其主要产物葡聚糖(glucan)在医药、精细化工、石油开采、食品、化妆品等领域等有广泛的应用。利用酶法生产葡聚糖,特别是固定化酶法生产葡聚糖可以控制产品分子的大小,降低产品中的杂质,提高产品质量,所以获得高活性及高纯度的葡聚糖蔗糖酶对生产具有重要的意义。本论文利用PCR方法从肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp dextranixum)基因组DNA中扩增出了葡聚糖蔗糖酶基因dsrD,并将其连接到克隆表达载体pET-30(a),得到重组质粒pET-30-dsrD,将重组质粒转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中,重组菌株SDS-PAGE结果显示有明显的170kD左右特异蛋白条带出现。葡聚糖蔗糖酶粗酶液在28℃时酶活力最高,当温度超过30℃时酶活力迅速降低,至50℃时几乎丧失活性,这说明温度对酶的催化活力影响很大。该重组酶最适作用温度为28℃;该工程菌中的葡聚糖蔗糖酶活性对环境的pH值变化较敏感,在pH为5.6时酶活力最高。经测定重组菌酶活力达1.2U/ml,约是原始菌株的30倍。
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