第一部分阳离子脂质微泡的制备及物理性能检测目的:制备表面电位为正电荷的阳离子脂质微泡(CMB),检测其外观形态、稳定性、分散度、粒径、表面电位等基本物理特征,通过评价CMBs体内、外显影的能力及超声敏感性,探寻低强度聚焦超声(LIFU)的适宜工作参数,为制备载质粒的阳离子微泡及超声介导的基因转染提供实验基础。方法:使用薄膜水化-机械振荡法,用DPPC和SPEG-PEG2000加入DC-Chol制备阳离子脂质微泡,用C3F8气体替换微泡空气内核,同时制备DIO标记的阳离子脂质微泡用以更清晰观察微泡的表面物理特征。分别用光镜、透射电镜、激光共聚焦显微镜观察微泡的外观形态及分散性,用细胞计数板检测微泡浓度,马尔文仪器检测微泡的粒径和Zeta表面电位。制备3%琼脂糖凝胶,检测阳离子脂质微泡的体外显影能力,使用LIFU在不同工作参数及辐照时间观察微泡被完全击破的时间,探索LIFU的最适应工作条件。使用百盛超声仪的高频探头定位颈动脉体的位置,并静脉注射CMBs,通过观察颈总动脉增强超声影像评价其体内显影能力。结果:CMBs由脂质外壳、内含C3F8气体构成,外观呈高密度乳白色,形态稳定。光学显微镜及共聚焦显微镜观察CMBs显示大小均一,分布均匀,TEM显示CMBs呈外壳光滑的球形。CMBs浓度为6.3±0.8*10~8/ml,粒径926.6±24.5nm,Zeta表面电位28.2±3.2mv。高频超声检测颈动脉体区域距离体表平均深度为2.95±0.17cm,CMBs可增强显示颈总动脉的超声影像。LIFU有效破裂3cm靶位点的声学参数及辐照时间分别是:焦距2.8±15%cm,功率6W/cm~2,焦域3.30×2.59×10.58 mm~3,占空比50%,辐照时间2min。结论:CMBs的物理性能良好,其阳离子电位及稳定性使其可结合质粒并防止质粒在体内被核酸酶降解,均一性及适宜大小使其具有良好的体内显影能力,为超声介导的靶向基因转染提供实验基础。第二部分低强度聚焦超声介导的基因转染靶向下调犬颈动脉体P2X3受体目的:探索低强度聚焦超声(LIFU)介导的载P2X3-g RNA阳离子微泡靶向转染颈动脉体(CB)下调P2X3受体表达的可行性,为无创调控CB活性治疗高血压提供实验基础。方法:使用CRISPR/Cas9系统构建P2X3-g RNA质粒,制备载P2X3-g RNA微泡,使用激光共聚焦显微镜观察阳离子微泡载质粒情况及流式细胞仪检测微泡与质粒结合的效率。采用经股动脉插管测量实验动物的血压,收缩压/舒张压≥140/90mm Hg纳入实验,将实验动物随机分为4组:Treatment组(n=14),Negative control组(n=10),LIFU+CMBs组(n=4),LIFU组(n=4)。静脉注射载P2X3-g RNA微泡,使用LIFU介导基因递送,6w/cm2辐照CB区域释放质粒及促进转染,百盛超声仪的LA523探头定位CB区域及实时监控微泡在颈总动脉内的循环,当增强显影消失则停止LIFU辐照。转染后72h用流式细胞仪检测CB细胞的GFP阳性细胞率,T7EI酶切法检测基因插入/缺失效率,Sanger测序检测突变位点,RT-q PCR检测P2X3受体的m RNA表达水平,Western blot检测P2X3受体的蛋白表达水平。结果:共聚焦显微镜显示P2X3-g RNA质粒能通过电荷形成复合物,流式结果示质粒与微泡的结合率为74.99%。使用高频超声探头能准确定位CB区域且协助LIFU介导的基因递送及基因转染,4ml浓度为1*108/ml微泡在颈总动脉血管可持续增强显影约2min。流式结果示CB细胞的GFP阳性率为33.15%,T7EI酶切法示基因的插入/缺失率为8.3%,Sanger测序检测出基因的突变位点。高血组犬与非高血压犬P2X3受体的m RNA及蛋白表达水平具有显著差异(P<0.05)。在Treatment组,RT-q PCR示P2X3受体的m RNA表达水平较Negative control组下降56.31%(P<0.05),Western blot示P2X3受体的蛋白表达水平下降45.1%,与LIFU组,LIFU+CMBs组及Negative control组比较具有显著的统计学意义(P<0.05)。结论:高血压犬CB的P2X3受体表达水平显著高于非高血压犬,与CB活性具有相关性,可作为调控CB治疗高血压的靶点。LIFU介导的载P2X3-g RNA质粒阳离子微泡靶向转染CB下调P2X3受体表达是一种无创的调控方式,具有可行性。第三部分低强度聚焦超声介导P2X3-g RNA转染犬颈动脉体治疗高血压的有效性及安全性评估目的:探索使用低强度聚焦超声(LIFU)介导的载P2X3-g RNA阳离子微泡靶向转染颈动脉体(CB)下调P2X3受体表达对CB活性的影响,评价其对高血压治疗的有效性及安全性。方法:3%戊巴比妥钠腹腔麻醉实验动物,采用经股动脉插管测量血压,收缩压/舒张压≥140/90mm Hg的动物纳入实验,并随机分为4组:Treatment组(n=8),Negative control组(n=4),LIFU+CMBs组(n=4),LIFU组(n=4)。分别采用以下干预手段:LIFU介导的载P2X3-g RNA阳离子微泡靶向转染CB,LIFU介导的载阴性对照质粒微泡靶向转染CB,LIFU辐照CB联合静脉注射阳离子微泡,仅LIFU辐照。分别在干预前、干预后第7天及第14天使用多道电生理记录仪记录实验动物的血压及心电波形,根据血压波形分析平均收缩压及平均舒张压,使用频域法分析心率变异性的LF,HF及LF/HF。使用Western Blot及免疫组化检测P2X3受体的表达。采集静脉血化验生化及血常规评估微泡对肝功、肾功及心脏是否产生不良影响,是否会产生系统炎症反应。取CB标本用HE染色判断组织结构是否有明显的热损伤。结果:LIFU组,LIFU+CMBs组,negative-control组及treatment组的基线血压没有显著统计学差异(P>0.05)。与基线血压相比,treatment组第14天的平均收缩压由152.5±3.0mm Hg降至138.0±2.9mm Hg(P=0.003),平均舒张压由97.8±1.5降至87.2±2.3 mm Hg(P=0.002),LF/HF由3.3±0.1降至1.7±0.1(P<0.001),LF由71.8±1.4 nu降至57.0±2.4nu(P<0.001),HF由22.4±1.2 nu升至34.5±1.9 nu(P<0.001),心率较基线水平下降(P<0.05)。其他三组的血压、心率及心率变异性和基线水平比均无显著统计学差异(P>0.05)。免疫组化及Western Blot示P2X3受体表达水平较干预前下降。生化及血常规均正常。CB的HE染色示组织及邻近血管无显著损伤。结论:使用LIFU介导的靶向基因转染CB既能下调CB活性又不破坏其结构,该策略用于治疗高血压具有效性及安全性。