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猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由冠状病毒科冠状病毒属成员猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。该病的主要临床特征为严重腹泻、脱水及迅速消瘦,2周龄以下仔猪死亡率可达100%,给养猪业带来了严重的经济损失。目前,TGE主要通过接种疫苗来进行预防控制,但是近年来流行的病毒处在一个毒力和生物学特性不断变异的动态过程中,传统疫苗已经达不到抵抗自然流行毒株的效果。本研究对我国河北地区的TGEV流行毒株进行了分离鉴定,并获得一株稳定的细胞传代毒株;对该分离毒株S、M基因进行了遗传进化分析,并探究了细胞自噬对该TGEV流行株复制的影响。本研究成果不仅为TGEV流行毒株致病机理等提供重要的理论基础而且对新型疫苗的研发上具有重要意义。本研究从河北某地采集临床表现为腹泻的仔猪粪便及小肠内容物,RT-PCR检测为TGEV阳性的病料处理后接种到PK-15细胞上进行传代,在盲传至第5代时出现典型的细胞病变。经RT-PCR检测,细胞培养物为TGEV 阳性,PEDV、PRoV、PDCoV检测结果均为阴性。根据Reed-Muench法计算得到第10代毒TCID50为10-5.5/0.1mL。间接免疫荧光实验进一步证实该病毒感染细胞后可以与TGEV兔源全病毒多抗发生特异性结合,出现特异性免疫荧光。证实该分离毒株为猪传染性胃肠炎病毒并命名为HB-FP 株。本研究对HB-FP分离株病毒S、M基因进行RT-PCR扩增,将获得的分离株S、M全基因与国内外TGEV毒株进行序列比对和遗传进化分析。结果显示,M基因未发生碱基的缺失或插入,分离株与参考株M基因之间核苷酸同源性都高于95%,与TGEV H16(FJ755618)核苷酸同源性最高为99.9%,氨基酸同源性为99.2%。HB-FP株S基因与其他参考毒株的核苷酸同源性为94.9%～98.8%,编码氨基酸同源性为65%～98%。进化树分析表明,HB-FP株除与英国TGEV株(AF104420)不在一个分支上外,与其他参考毒株都在同一分支上,其中中国的TGEVJS2012(KT696544)株、美国的TOY56-165(M94103)株、韩国的TGEV(AF298211)株与分离株HB-FP株亲缘关系最近。氨基酸变异分析表明,分离株与常用的疫苗株存在21处氨基酸点突变,其中有7处点突变在S蛋白的抗原表位区,这种抗原位点的突变对TGEV生物学特性的影响还有待进一步研究。本研究将不同病毒量的TGEV HB-FP株感染PK-15细胞,通过免疫印迹试验检测自噬相关蛋白的表达水平,证实了 TGEV感染可引起PK-15细胞自噬现象。紫外线灭活后的病毒可以引起细胞自噬,虽然与对照组相比LC3-Ⅱ/β-actin表达量有提升,但是其诱导自噬的能力较正常病毒组下降明显,表明经紫外线灭活的TGEV未完全失去诱导PK-15细胞自噬的能力,但是病毒的复制过程可以促进宿主细胞自噬程度。探究细胞自噬对TGEV病毒增殖的影响,结果显示自噬促进剂雷帕霉素预处理PK-15细胞后可以增加TGEV的病毒滴度,而经自噬抑制剂3-MA处理PK-15细胞后抑制了 TGEV的复制,结果证实自噬可以促进TGEV在PK-15细胞上的复制。经TGEV HB-FP株感染PK-15细胞后自噬关键因子Beclin-1、ATG5基因mRNA转录量在分离株病毒感染细胞后都得到显著提升,结合病毒的增殖曲线印证了 TGEVHB-FP株在感染PK-15细胞后,病毒增殖与细胞自噬程度呈正向作用。研究结果为进一步探索TGEV HB-FP株与宿主细胞相互作用及TGEV的发病机制提供了新的视角。