论文部分内容阅读
B细胞淋巴瘤滤过性病毒插入位点1(B cell-specific MLV integration site-1,Bmi1)基因属于Polycomb基因家族成员,与多种干细胞的自我更新相关,其缺失将会引起小鼠生长阻滞及成熟前衰老。然而,Bmi1缺失是否会影响精子发生尚不清楚。本研究主要利用Bmi1敲除小鼠,观察Bmi1缺失对精子发生的影响,此外,就Bmi1缺失引起精子发生障碍的相关分子机制进行深入研究。我们首先利用RT-PCR、免疫荧光及免疫组化技术检测了 Bmi1在睾丸组织中的相对表达及其分布。结果发现:相较于心、肝、脾、肾等其它器官,Bmi1在睾丸组织中的表达水平最高,约为肝脏的140倍。此外,Bmi1几乎定位于所有生精细胞中,并且支持细胞上也有较高表达。上述结果提示Bmi1在精子发生过程中可能有着重要作用。为了明确Bmi1对雄性生殖的影响,我们利用Bmi1敲除(Bmi1-/-)小鼠,通过交配实验、检测睾丸大小、重量、CASA精子计数和HE染色等,比较分析WT和Bmi1-/-雄鼠生殖表型的差异。结果发现:相较于WT小鼠,Bmi1-/-雄鼠完全不育、睾丸明显减小、重量明显降低、生精结构紊乱以及精子成熟障碍。这些结果证明Bmi1缺失引起不育以及严重的精子发生障碍。为了明确Bmi1缺失引起的精子发生障碍是否与睾酮合成降低有关,我们利用血清学、Western-blot、RT-PCR以及流式细胞术,比较分析了WT和Bmi1-/-雄鼠血清中睾酮水平、睾酮合成相关酶3 β HSD以及17 β HSD的表达水平以及睾丸间质细胞的变化。结果发现:相较于WT小鼠,Bmi1-/-雄鼠血清中睾酮水平、睾酮合成相关酶3 β HSD以及17 β HSD的表达水平均明显降低,睾丸间质细胞明显减少。这些结果证明Bmi1缺失能够通过减少睾丸间质细胞、下调睾酮相关酶的表达水平,从而降低睾酮的合成。为了明确Bmi1缺失对生精细胞增殖及凋亡的影响,我们利用免疫组化及TUNEL染色方法,比较分析WT和Bmi1-/-雄鼠精原细胞增殖、凋亡情况及精母细胞数量。结果发现:相较于WT小鼠,Bmi1-/-雄鼠曲细精管Ki67阳性细胞数目明显减少、细胞凋亡显著增加及精母细胞数量减少。这些结果证明Bmi1缺失引起精原细胞增殖降低、精母细胞凋亡增加及数量减少。为了明确Bmi1缺失是否引起精子成熟障碍,我们通过精子HE及Mito-tracker染色、附睾尾电镜分析以及RT-PCR等方法,比较分析WT和Bmi1-/-雄鼠精子形态、精子线粒体鞘中线粒体含量以及睾丸组织中精子变形相关基因表达水平的变化。结果发现:较WT雄鼠相比,Bmi1-/-雄鼠精子头部异常、精子畸形率显著增加,精子核浓缩及顶体形成异常,睾丸组织中精子变形相关基因tnp1、tnp2、prm1、prm2、h1fnt、spem1表达水平均显著下调及附睾尾部线粒体鞘中线粒体含量明显减少。这些结果说明Bmi1在精子变形过程中如核浓缩、顶体形成以及线粒体鞘形成起有重要作用。Bmi1在支持细胞中表达。为了明确Bmi1缺失对睾丸中支持细胞的影响,我们通免疫组化染色,比较分析WT和Bmi1-/小鼠睾丸支持细胞数量及形态。结果发现:较WT雄鼠相比,Bmi1-/-雄鼠睾丸支持细胞数量并无明显差异,但支持细胞胞体严重退化,支持细胞臂长明显缩短。这些结果说明Bmi1在维持支持细胞胞体的正常结构具有重要作用。为了明确Bmi1缺失引起的精子发生障碍是否与精原干细胞功能异常有关,我们利用免疫荧光及流式细胞术,比较分析WT和Bmi1-/-雄鼠精原干细胞数目、比例、增殖及DNA损伤情况。结果发现:相较于WT小鼠,Bmi1缺失精原干细胞的数量和比例均上升、增殖正常及DNA损伤增加。这些结果证明Bmi1缺失并不影响精原干细胞池。为了明确Bmi1缺失对生精损伤之后精原干细胞增殖启动的影响,我们利用白消安造成小鼠生殖损伤模型,通过HE及免疫荧光等技术,比较分析WT、Bmi1-/-、白消安处理的WT及白消安处理的Bmi1-/-雄鼠生精结构损伤、生精细胞包括精原干细胞的增殖、DNA损伤情况以及精原干细胞数量的变化。结果发现:相较于WT小鼠,Bmi1-/-小鼠在白消安处理2W后其生精损伤更为严重、DNA损伤增加、细胞增殖则被显著抑制,但精原干细胞的数目、增殖及DNA损伤未显明显差异;Bmi1-/-小鼠白消安处理3W后,睾丸部分曲精小管管腔只剩下精原干细胞,而WT小鼠生精结构则较为完整,但Bmi1-/-小鼠精原干细胞的数目较WT有增多趋势。这些结果证明尽管Bmi1缺失对白消安造成的生精损伤更加敏感,但对精原干细胞增殖的启动并无显著影响。Bmi1不仅可以转录抑制p16及p19基因的表达,另外在抗氧化防卫中还起着重要作用。为了明确Bmi1缺失引起精子发生障碍是否与p16、p19信号通路的激活及氧化应激的增加相关,我们通过免疫组化、Western-blot技术、Real-time RT-PCR、流式细胞仪及生化检测,比较分析WT和Bmi1-/-雄鼠p16、p19-p53信号通路分子、氧化应激及DNA损伤反应相关指标的变化。结果显示:相较于WT小鼠,Bmi1-/-雄鼠p16、p19、p53、p21等蛋白表达水平上调、氧化应激水平以及DNA损伤反应增加。这些结果证明,Bmi1缺失引起睾丸组织中p16、p19-p53信号通路激活、氧化应激及DNA损伤增加。为了明确p16、p53信号通路的激活和氧化应激的增强是否在介导Bmi1缺失引起的精子发生障碍中发挥着重要作用,我们通过构建p16或p53与Bmi1双基因敲除小鼠以及给予Bmi1-/-雄鼠抗氧化剂NAC或者PQQ补充,通过检测睾丸大小、重量、CASA精子计数、HE染色及免疫组化等技术,比较分析WT、Bmi1-/-、双敲小鼠以及抗氧化剂补充组小鼠生殖表型的差异。结果发现:相较于Bmi1-/-小鼠,p16-/-Bmi1-/-、p53-/-Bmi1-/-及 NAC 或者 PQQ 补充的 Bmi1-/-雄鼠睾丸大小均增大、睾丸重量及精子数量均明显增加,生精结构也都趋于正常,但均未恢复到WT小鼠水平;p16-/-Bmi1-/-、p53-/-Bmi1-/-及NAC或者PQQ补充的Bmi1-/-雄鼠睾丸γ H2A.X 阳性细胞数明显降低、PCNA阳性细胞数明显增加以及TUNEL阳性生精细胞明显减少。这些结果证明p16、p53及氧化应激在介导Bmi1缺失引起的精子发生障碍过程中起有重要作用。为了明确氧化应激、p16及p19-p53通路间相互调节作用,我们通过Western-blot 技术,比较分析 WT、Bmi1-/-、p16-/-、p53-/-、p16-/-Bmi1-/-、p53-/-Bmi1-/-以及抗氧化剂补充的Bmi1-/-雄鼠睾丸中p16、p19、p53及p21蛋白表达的变化。结果发现:NAC或者PQQ补充能够明显降低Bmi1-/-雄鼠p19、p53、p21及p16的蛋白表达水平;相较于WT小鼠,p19和p53蛋白表达水平在p16-/-雄鼠睾丸组织中明显上调,而p16蛋白表达水平在p53-/-雄鼠睾丸中明显上调;而相较于Bmi1-/-雄鼠,p19和p53蛋白表达水平在p16-/-Bmi1-/-雄鼠睾丸组织中明显上调,而p16蛋白表达水平在p53-/-Bmi1-/-雄鼠睾丸组织中明显上调。这部分结果说明p53基因敲除或p16基因敲除在纠正Bmi1缺失引起的精子发生障碍中,部分分别被p16信号通路或p19-p53信号通路代偿性激活所降低;而抗氧化剂补充不仅能够通过抑制氧化应激,发挥纠正Bmi1缺失引起精子发生障碍的直接作用,而且能够通过抑制p16及p19-p53信号通路,发挥纠正Bmi1缺失引起精子发生障碍的间接作用。本研究结果不仅揭示了 Bmi1缺失引起雄性不育的分子机制,而且将为临床治疗男性不育提供了新的靶标和实验依据。