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背景和目的肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率居高不下,其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占全部肺癌的80%以上。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）是NSCLC最重要的驱动基因之一,EGFR信号通路与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）是治疗晚期NSCLC的有效靶向药物。然而EGFR-TKI治疗后几乎所有初始治疗有效的患者最终都会出现EGFR-TKI获得性耐药,TKI耐药极大的影响了病人的远期生存。近年来研究表明,肺癌EGFR-TKI获得性耐药的机制包括EGFR第20外显子T790M继发性突变、以MET（mesenchymal epithelial transition factor）和HER2（human epidermal growth factor receptor-2）基因等为代表的旁路基因激活、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha,PIK3CA）突变、上皮细胞向间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）及肿瘤病理类型向小细胞肺癌转化等,另外有15%-30%的病人耐药机制不明。而在现有的临床实践中,对于肺癌EGFR-TKI获得性耐药机制尚不明确的患者,目前尚无成熟和广泛接受的二线治疗方案。既往有研究报道对于肺癌EGFR-TKI获得性耐药的患者,后续给予培美曲塞化疗可以逆转TKI的耐药,并且显著改善患者生存。但是该治疗模式的具体机制、适应证以及最佳的用药时间目前尚不清楚。本论文首先在临床层面上探讨晚期NSCLC患者在EGFR-TKI一线治疗获得性耐药后,培美曲塞化疗间插TKI治疗（简称间插治疗）模式对患者疗效及生存期的影响。其次,本论文将在分子水平上探索miR-873通过靶向GLI1基因在NSCLC产生EGFR-TKI获得性耐药中的潜在作用及可能的调控机制。最后,本论文将通过研究培美曲塞对人肺癌EGFR-TKI获得性耐药细胞株的作用,进一步探讨间插治疗模式可能逆转EGFR-TKI耐药的具体机制。第一部分间插治疗模式在EGFR-TKI一线治疗获得性耐药后的晚期NSCLC中的临床观察方法选择2013年01月2017年12月期间在南京医科大学第一附属医院经病理确诊并接受EGFR-TKI一线治疗的晚期NSCLC患者共103例,入组患者在治疗前均接受EGFR基因检测证实为EGFR敏感突变型。EGFR-TKI一线治疗方案包括吉非替尼250 mg,1次/日,或厄洛替尼150 mg,1次/日,或埃克替尼125 mg,3次/日,所有患者在第一代EGFR-TKI治疗进展时均要求符合TKI获得性耐药标准（Jackman,2010）。根据二线治疗策略的不同,入组患者分为培美曲塞化疗间插TKI治疗组（后文中简称为间插治疗组）,有52例病人;以及单纯化疗组（后文中简称为单纯化疗组）,有51例病人。分析两组患者的近期疗效及无进展生存期（progression-free survival,PFS）和总生存期（overall survival,OS）。部分患者在EGFR-TKI耐药后接受外周血T790M突变检测,根据检测结果区分为T790M突变阳性和阴性亚组,进一步分析接受上述两种治疗策略患者的近期疗效及PFS、OS。结果103例患者均可评价一线EGFR-TKI治疗进展后二线治疗的近期疗效及PFS、OS。间插治疗组和单纯化疗组的近期有效率（overall response rate,ORR）分别为30.8%和19.6%（P=0.192）,疾病控制率（disease control rate,DCR）分别为76.9%和52.9%（P=0.011）,间插治疗组DCR显著高于单纯化疗组。间插治疗组和单纯化疗组的中位PFS分别为8个月和6个月（P=0.003）,Cox多因素生存分析提示间插治疗组的PFS显著优于单纯化疗组（HR=0.380,95%CI=0.222-0.651,P=0.000）。间插治疗组和单纯化疗组的中位OS分别为17个月和11个月（P=0.001）,Cox多因素生存分析提示间插治疗组的OS显著优于单纯化疗组（HR=0.319,95%CI=0.189-0.537,P=0.000）。在一线TKI进展后有条件接受外周血EGFR T790M突变检测并且结果为T790M（-）的患者中,间插治疗组和单纯化疗组的DCR分别为100.0%和50.0%（P<0.001）,中位OS分别为19个月和11个月（P=0.020）,该结果说明间插治疗组的DCR和OS显著优于单纯化疗组。第二部分MiR-873靶向GLI1基因调控非小细胞肺癌EGFR-TKI获得性耐药的机制研究方法1.体外培养人非小细胞肺癌EGFR-TKI的耐药细胞株PC9/GR以及EGFR-TKI的敏感细胞株肺PC9,实时定量PCR（quantitive real-time PCR,q PCR）检测PC9/GR和PC9细胞中miR-873以及GLI1的表达情况并分析二者表达水平的相关性。2.在PC9细胞中转染miR-873 inhibitor,采用q PCR和蛋白免疫印记（Western Blot）检测GLI1的表达情况。3.在PC9细胞中转染miR-873 mimics及GLI1-3’UTR/GLI1-3’UTR mut荧光素酶报告载体,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测miR-873是否直接靶向调节GLI1的表达。4.用吉非替尼处理PC9细胞,并应用细胞转染技术,在PC9细胞中转染miR-873 inhibitor。然后采用CCK-8、体外模拟血管生成、流式细胞术等检测各组细胞的细胞活力、血管生成、细胞增殖的情况。并利用q PCR和Western Blot检测GLI1的表达情况。结果1.相比PC9/GR细胞,miR-873在PC9细胞中的表达较高（P<0.05）;相反,GLI1在PC9/GR细胞中呈现高表达水平;二者的表达水平呈现负相关（P<0.05）。2.PC9细胞转染miR-873 inhibitor后,miR-873表达下调,GLI1的表达上调（P<0.05）。3.GLI1是miR-873的靶标基因。双荧光素酶报告基因实验表明:在GLI13’UTR野生型荧光素酶报告基因检测中,转染miR-873 mimics后,与阴性对照组比较,萤光素酶活性明显下降（P<0.05）。在GLI1 3’UTR-mut突变型荧光素酶报告基因检测中,转染miR-873 mimics后,与阴性对照组比较,萤光素酶活性无明显变化（P>0.05）。4.MiR-873的下调增强PC9细胞活力。CCK-8法检测转染miR-873 inhibitor并经吉非替尼（gefitinib）处理的PC9细胞活力。结果显示:孵育48 h、72 h和144 h后,miR-873 inhibitor+gefitinib转染组PC9的细胞活力明显高于miRNA control+gefitinib处理组（P<0.05）。5.MiR-873的下调增强PC9细胞的血管生成。血管生成实验结果显示:miR-873 inhibitor+gefitinib转染组PC9的细胞血管生成明显高于miRNA control+gefitinib处理组（P<0.05）。6.MiR-873的下调增强PC9细胞的增殖。CFSE流式细胞检测实验结果显示:miR-873 inhibitor+gefitinib转染组PC9的细胞增殖明显高于miRNA control+gefitinib处理组（P<0.05）。7.MiR-873的下调增加PC9细胞GLI1的表达。q PCR和Western Blot检测转染PC9细胞中GLI1的蛋白表达,结果显示:与miRNA control+gefitinib处理组比较,miR-873 inhibitor+gefitinib转染组GLI1的蛋白表达水平明显上升（P<0.01）。第三部分培美曲塞对人肺癌EGFR-TKI获得性耐药细胞株的作用及机制研究方法1.培美曲塞作用于人肺癌EGFR-TKI获得性耐药细胞株PC-9/GR 48h后,将培美曲塞药物进行洗脱,比较耐药细胞株在培美曲塞处理前后对EGFR-TKI的治疗敏感性。2.Western blot法检测培美曲塞对肺癌细胞中（包括EGFR-TKI耐药细胞PC-9/GR及EGFR-TKI敏感细胞PC-9）GLI1蛋白表达的影响,q PCR法检测培美曲塞作用前后miR-873表达的变化。结果培美曲塞处理后的EGFR-TKI耐药细胞PC-9/GR对EGFR-TKI治疗重新出现敏感,培美曲塞能抑制EGFR-TKI耐药细胞中GLI1蛋白的表达,并上调miR-873基因的表达。结论首先,在临床上对于晚期NSCLC患者EGFR-TKI一线治疗获得性耐药后提倡进行T790M等耐药基因的检测。若T790M突变阴性,给予培美曲塞化疗并间插TKI治疗,疗效优于单纯化疗且耐受性良好,可能逆转TKI耐药。其次,miR-873与GLI1在NSCLC细胞系中的表达水平呈显著负相关,GLI1是miR-873的靶基因。下调miR-873的表达可增加肺癌PC9细胞中GLI1的表达,并降低肺癌细胞对吉非替尼的敏感性、增强肺癌细胞活力、促进肺癌细胞血管生成和细胞增殖。最后,培美曲塞能上调肺癌PC-9/GR细胞miR-873的表达,导致GLI1表达水平的降低,从而可能逆转肺癌PC-9/GR细胞的EGFR-TKI获得性耐药作用。这也为间插治疗模式在临床上逆转肺癌EGFR-TKI获得性耐药提供了一定的理论依据。