蜡样芽孢杆菌D2是一种能够在低温中生存的具有修复重金属土壤功能的耐冷菌,但是目前国内外学者还是主要关注此菌对重金属污染土壤的修复,对其冷适应机制尚未报道。冷休克蛋白是微生物在低温环境下表达协助机体恢复正常生命活动的一种蛋白质,是微生物适应低温环境不可或缺的一部分。本研究以蜡样芽孢杆菌D2为研究对象,测定了蜡样芽孢杆菌D2在不同温度下的生长曲线,并以此为基础构建了阿伦尼乌斯曲线,以确定后续的冷诱导温度。然后通过生物信息学方法,参照NCBI中数据库筛选蜡样芽孢杆菌D2的冷休克蛋白,并利用PCR扩增和测序鉴定它们的基因。利用Tricine-SDS-PAGE分析冷诱导前后的蛋白质表达变化,并使用qRT-PCR比对筛选出来的冷休克蛋白基因在冷诱导前后mRNA的表达水平,找出冷诱导后的高表达冷休克蛋白。将蜡样芽胞杆菌D2高表达的冷休克蛋白过表达于大肠杆菌中,检测低温生长情况,确定关键冷休克蛋白。利用MEGA 7.0软件比对NCBI中其他不同细菌的冷休克蛋白的氨基酸序列,构建基于蜡样芽胞杆菌D2冷休克蛋白的蛋白质系统发育树。最后通过疏水性氨基酸数量和比例、一级结构、二级结构和空间结构的比较,分析关键冷休克蛋白的结构特点。蜡样芽胞杆菌D2不同温度下的生长曲线显示,该菌株随着温度的下降,生长速度急剧下降,8℃时生长速度较为缓慢。从阿伦尼乌斯曲线可看出,8℃到10℃的生长速度变化速率比10℃到15℃时要慢,表明在10℃时,该菌株对温度变化最为敏感,从而选定了10℃作为冷诱导温度。根据数据库比对在该菌株中筛选出6个冷休克蛋白,并克隆测序验证其存在,命名为Csp1-6。冷诱导2h后,蜡样芽孢杆菌D2表达出7kD的差异蛋白质,与冷休克蛋白预期分子量一致。实时荧光定量PCR表明,Csp1、Csp2、Csp3和Csp6的mRNA表达水平在冷诱导后显著上升。构建了相应的Csp-pet-28a载体,在大肠杆菌中过表达,发现Csp2和Csp6对细菌在低温生长的促进作用最为显著,所以将这两个冷休克蛋白定义为蜡样芽孢杆菌D2的关键冷休克蛋白。氨基酸序列和结构的比对结果显示Csp2和Csp6分别属于CspB和CspC家族,而且发现在关键冷休克蛋白中丙氨酸含量较高,并提出了在亮氨酸上形成α螺旋可能是关键冷休克蛋白与其他冷休克蛋白的主要区别。以上研究为实际应用中耐冷微生物和冷休克蛋白的利用和研究,提供一定的理论依据。