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动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）起病隐匿,病因复杂多样且常伴随恶性心脑血管事件的发生,而传统的治疗手段疗效有限,因此,需要寻找新的防治策略。血管内皮细胞对维持血管稳态发挥重要作用,其功能损伤是目前公认的AS起始因素。血管内皮细胞被认为是高度活跃的内分泌器官,研究由其合成与分泌的蛋白对阐明AS发生机制具有重要价值。Metrnl是本实验室利用限食模型和生物信息学方法发现的一个全新脂肪因子,前期本室研究结果提示,Metrnl在血管内皮细胞中表达很丰富,内皮细胞可以分泌Metrnl,是血液Metrnl的主要来源,故Metrnl可能是内皮维持血管稳态所需的活性物质。本课题旨在探索内皮Metrnl对高脂诱导的及自发性的AS发生发展的作用及机制,为将Metrnl蛋白作为AS的新防治靶标提供理论依据。研究目的1.考察动脉粥样硬化性高脂饲料对小鼠基本生理指标的影响;2.研究内皮Metrnl在高脂诱导及自发性的AS发生发展中的作用;3.探索内皮Metrnl对AS作用的机制。研究方法1.以动脉粥样硬化性高脂饲料喂养C57BL/6J及Apo E-/-小鼠,考察小鼠的体重、血糖血脂等情况,并探讨禁食时间对血脂检测结果的影响。2.将实验室前期已构建成功的内皮细胞Metrnl特异性敲除小鼠(Metrnllox P/lox PTek-Cre,简称EC-Metrnl-/-),与Apo E-/-小鼠杂交得到Apo E-/-EC-Metrnl-/-小鼠及同窝对照小鼠(Apo E-/-WT)。检测比较两组小鼠主动脉等组织的Metrnl表达情况及血液Metrnl蛋白浓度。3.考察Apo E-/-EC-Metrnl-/-及其对照小鼠在三种不同条件下的动脉粥样硬化形成情况:（1）小鼠自2-3月龄起开始高脂饮食,为期10周,考察内皮Metrnl对高脂诱导的动脉粥样硬化的作用;（2）小鼠自7-9月龄起开始高脂饮食,为期10周,考察内皮Metrnl对高脂诱导的动脉粥样硬化的作用;（3）小鼠正常饮食至1岁以上,考察内皮Metrnl对自发性动脉粥样硬化的作用。检测比较两组小鼠的主动脉粥样硬化斑块面积、主动脉根部脂质沉积与坏死。4.F4/80、IL-6分子免疫组化实验考察Apo E-/-EC-Metrnl-/-小鼠及其对照小鼠主动脉根部炎性细胞浸润情况。5.细胞水平考察Metrnl缺乏对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）在正常条件及受氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）刺激条件下的细胞炎症影响。6.在m RNA和蛋白水平分别验证正常小鼠主动脉及骨髓Metrnl的表达情况,并考察EC-Metrnl-/-小鼠骨髓Metrnl的敲减率。结合骨髓移植法（bone marrow transplanation,BMT）考察骨髓Metrnl非特异性敲除对AS的作用,具体过程为:以Apo E-/-EC-Metrnl-/-小鼠及同窝对照小鼠Apo E-/-WT为供体鼠,以Apo E-/-小鼠为受体鼠,先将受体鼠经过Co60照射损毁骨髓,然后将提取的供体鼠骨髓细胞分别移植至受体鼠体内,恢复1个月后给予小鼠高脂饮食10周,考察两组小鼠AS斑块情况。研究结果1.相比于正常饮食组,给予动脉粥样硬化性高脂饮食的C57BL/6J及Apo E-/-小鼠体重增加,血糖、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）水平显著升高,而血清甘油三酯（TG）明显下降。相比于未禁食组,禁食12 h后检测到的TG水平明显降低。2.Apo E-/-EC-Metrnl-/-小鼠的主动脉Metrnl m RNA表达量明显减少,而其他组织表达不变。并且,该组小鼠血清Metrnl水平大幅度下降,与前期对EC-Metrnl-/-小鼠Metrnl的表达研究结果相符。3.Apo E-/-EC-Metrnl-/-小鼠及其对照小鼠在2-3月龄时开始给予高脂饮食10周后均产生较轻微的AS斑块,但Apo E-/-EC-Metrnl-/-小鼠的主动脉斑块面积、主动脉根部脂质堆积及坏死损伤明显比对照组小鼠严重,而两组小鼠的体重、进食量、血糖、血脂均无显著性差异。两组小鼠在7-9月龄时开始给予高脂饮食10周,或以正常饮食饲养至1岁以上,都产生较严重的AS斑块,类似地,Apo E-/-EC-Metrnl-/-小鼠的主动脉粥样硬化情况均更加严重。4.Apo E-/-EC-Metrnl-/-小鼠主动脉根部的F4/80和IL-6免疫组化染色比对照小鼠更深,提示该组小鼠主动脉炎症浸润加重。5.体外实验发现,Metrnl敲减后的HUVECs在正常培养条件下即发生促炎因子IL-6、IL-1β和趋化因子MCP-1表达量显著上升,而在ox-LDL刺激条件下,会引起促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达量上升。6.正常小鼠骨髓有Metrnl表达,但表达量远低于主动脉。EC-Metrnl-/-小鼠的骨髓Metrnl存在一定程度敲除。高脂饮食10周后,与接受Apo E-/-WT供体小鼠骨髓移植的Apo E-/-小鼠相比,接受Apo E-/-EC-Metrnl-/-供体小鼠骨髓移植的Apo E-/-小鼠其AS斑块无明显变化。结论本研究明确了内皮Metrnl缺乏可促进高脂诱导及自发性AS的发生发展,机制研究发现与内皮细胞缺乏Metrnl可加重细胞炎症有关,Metrnl有望成为防治AS的新靶标。此外,本研究显示,动脉粥样硬化性高脂饲料显著升高小鼠血清TC及LDL-c水平,但明显降低TG值;12小时禁食可影响血清TG检测结果,但不影响其他血脂指标。