土壤是微生物最主要的栖息地,据估计土壤中有4-5×1030个微生物细胞。然而,由于99%的微生物不能培养,所以难以得到非培养微生物的全部信息。宏基因组方法克服传统微生物培养的局限性,能够充分挖掘和利用土壤非培养微生物基因资源。本研究采用宏基因组方法,从西藏高寒草甸土壤、华北温室黄瓜地土壤微生物中筛选具有杀线虫活性的基因。1.土壤微生物总DNA的提取方法比较由于土壤含有丰富的有机质和腐植酸,微生物DNA提取和纯化极其困难,采用直接法和间接法提取土壤微生物总DNA,并比较不同土样的的产率以及纯度的,经电泳纯化法后更适合于构建大插入片段文库。另外,发现土壤pH、有效P、有效K及有机质会影响DNA的产率。2.西藏高寒草甸土壤、华北温室黄瓜地土壤微生物PKS KS和NRPS A基因的筛选和功能分析采用直接法提取的2种土壤微生物总DNA,简并引物进行PCR扩增,对土壤微生物的PKS和NRPS基因家族多样性进行研究,结果表明：从2种土壤微生物总DNA中共计得到37个PKS-KS基因(草甸土样28个、温室土样9个),40个NRPS-A基因(草甸土样24、温室土样16个)。经过BLASTX比对发现这些基因与已知的PKS(相似性57-82%)和NRPS(相似性47-67%)基因相似性较低,表明它们为新基因类型。3.西藏高寒草甸土壤、华北温室黄瓜地土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建采用间接法提取和纯化2种土壤微生物总DNA,构建西藏米拉山高原草甸土壤、华北温室黄瓜地土壤微生物宏基因组Fosmid文库。西藏土壤Fosmid文库包含30 624个克隆,华北温室土壤Fosmid文库包含31 008个克隆,克隆的平均插入片段为30 kb；文库克隆稳定,无插入片段丢失或重排。通过末端测序分析发现华北温室土壤Fosmid文库中无同源序列占92.75%,而西藏土壤Fosmid文库中无同源序列占94.3%。这表明2个文库包含大量未知微生物物种,从而为挖掘新的功能基因研究奠定基础。4.含PKS基因克隆筛选及其杀线虫活性测定设计PKS基因KS域的简并引物,从2个土壤宏基因组文库克隆中进行PCR扩增序列筛选,共计得到7个含PKS基因的克隆。从华北温室文库获得的4个含PKS基因克隆,其PKS基因片段的长度为693 bp、699 bp、699 bp、698 bp。从西藏文库得到3个含PKS基因的克隆,其中K99携带有2个KS基因。对筛选的PKS基因克隆经LB液体培养基培养4 d,以培养菌液浸泡线虫法测定对南方根结线虫J2、松材线虫J2的致死活性,结果表明克隆K99的杀线活性最强,其培养菌液处理12 h对两种靶标线虫的致死率为100%。温室盆栽实验表明,克隆K99对南方根结线虫的防效为89%。5.克隆K99杀线虫活性物质的研究通过正丁醇萃取克隆K99培养菌液和甲醇萃取菌体来检测克隆K99的活性物质,结果表明,培养菌液和菌体粗提物对松材线虫的12 h致死率分别为100%和96%。粗提物经121℃处理20min后活性不变,表明活性物质的热稳定性良好。用薄层层析追踪法表明：极性中等的C1、C2、C3条带均有杀线虫活性,而极性小的C5和极性大的C4无活性。这表明克隆K99的杀线虫活性物质可能为一种极性中等、热稳定性好的聚酮类物质。6.一株含PKS基因放线菌杀线虫活性鉴定根结线虫拮抗放线菌F001的发酵液对松材线虫也有致死活性,采用PCR的方法验证其是否PKS KS域基因和NRPS A域基因,并优化其发酵条件。结果表明,F001基因组中含有PKS基因和NR S基因,经Blastx比对,与已知的放线菌的相关基因相似性较高；得到最佳产杀线活性物质的培养条件是培养温度28℃、摇床转速180 r／min、装液量200mL(250 mL三角瓶)、初始pH7.0培养9 d。总之,从2个宏基因组文库中获得多个具有杀线虫活性的克隆,尤其是克隆K99具有较高的活性,其代谢产物为极性中等,且热稳定性良好的聚酮类物质。这值得进一步研究开发。