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研究目的:柴胡是《伤寒杂病论》中应用比较广泛和重要的药物之一,本实验的主要目的是合成柴胡皂苷D(SSD)的人工抗原与人工包被原,制备中药活性成分SSD的单克隆抗体,利用SSD单克隆抗体建立相应的酶联免疫吸附分析方法,检测含柴胡的中药复方中SSD含量,为中药复方质量控制提供新的技术方法,也为后续对经方中柴胡的作用机制和机理的研究奠定基础。研究方法:(1)采用高碘酸钠氧化法合成SSD的人工免疫抗原(SSD-BSA)和人工包被原(SSD-OVA),并且使用薄层色谱法对合成产物进行鉴定;(2)用合成的SSD-BSA多次免疫BALB/c小鼠后,通过ELISA方法测定免疫小鼠抗SSD血清的效价和特异性;(3)取出免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,采用PEG法进行融合,再进行单克隆细胞株的筛选,采用腹水诱导法生产大量的单克隆抗体;(4)利用制备的SSD单克隆抗体建立ELISA方法,测试该方法的特异性、灵敏度、交叉反应率、回收率、准确性等相关指标;(5)利用建立SSD免疫分析方法,检测五种含有柴胡的复方中SSD含量。研究结果:(1)薄层色谱法鉴定的结果说明,合成的产物SSD-BSA和SSD-OVA偶联成功;小鼠的血清效价在1:10000以上,标准竞争抑制曲线表明,血清中的抗体可与SSD产生特异性结合。取免疫的小鼠脾细胞进行细胞融合,筛选出能分泌抗SSD抗体的单克隆细胞株。基于制备的SSD单克隆抗体,建立相应的ELISA分析法。(2)方法学考察结果显示,在156.25～5000ng/mL范围内,包被原SSD-OVA以1:4000的浓度稀释,腹水以1:100000的浓度稀释,得到SSD单克隆抗体的抑制率与线性关系曲线,回归方程为:y=-0.158In(x)+1.7693,R2=0.9856。IC50为 425.81 ng/mL。回收率在98.15～104.37%(均值为101.19%),板内差异<8.16%,板间差异<13.78%。通过ELISA法测试SSD与其它中药活性成分反应的交叉反应率。结果显示SSD与其他成分的交叉反应率均小于0.10%。说明制备的SSD单克隆抗体有很好的特异性。研究结论及意义:本实验首次成功的合成了 SSD的人工抗原,为SSD单克隆抗体的筛选和制备以及相应免疫方法的建立奠定基础;首次筛选出SSD的单克隆株;首次制备出SSD的单克隆抗体;首次利用生产出的SSD的单克隆抗体建立酶联免疫吸附分析方法。这些研究可以为中药复方中柴胡的质量监控提供新的检测方法,而且为药物有效成分的分离研究、中药复方有效物质基础的研究、体内代谢、作用机理等的研究奠定基础。