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研究目的：本实验旨在初步研究丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞的抑制作用及对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响,并分析其可能作用机制。藉此为指导临床使用丹参酮Ⅰ治疗人乳腺癌提供理论依据。研究方法：1.体外实验选择不同浓度(2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μg/ml)丹参酮Ⅰ,分别与人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453细胞孵育一段时间后,(1)利用Cell Counting Kit-8法检测丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453细胞的增殖和细胞毒性；(2)采用平板克隆形成试验观察丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453细胞克隆形成率的影响；(3)DAPI染色观察丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞形态的影响；(4)采用流式细胞仪测定不同浓度丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453细胞凋亡率的影响；(5)采用流式细胞仪测定不同浓度丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453细胞周期的影响；(6)Western blot法检测丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞周期相关蛋白表达的影响；(7)Western blot法检测丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响以及PI3K抑制剂LY294002干预对PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响。2.体内实验(1)裸鼠皮下成瘤实验：将人乳腺癌MCF-7细胞(1×106/0.1m1)分别接种至裸鼠的背部,2-3周后,观察所成肿瘤大小及侵袭的范围。(2)裸鼠成瘤后的药物处理：当肿瘤长到90mm3时开始治疗,将动物按肿瘤大小和体重随机分成3组(6只/组),即对照组[注射99%乙醇和1%Tween-20(0.1mg/10g体重)]；低剂量Tan I组(5mg/kg);高剂量Tan I组(15mg/kg)。每周腹腔注射4次,连续3周,期间动态监测和观察裸鼠的生理状况、卡尺法测量裸鼠人乳腺癌皮下肿瘤的体积变化、计算人乳腺癌细胞荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率：当对照组平均瘤体体积达到3750.5mm3时,终止实验进程,处死裸鼠、观察瘤体周围组织的浸润和称量裸鼠瘤体的重量。研究结果：1.体外实验1.1丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞生长抑制作用和克隆率的影响1.1.1 Cell Counting Kit-8法检测结果显示,丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞系具有更明显的抑制增殖作用,其抑制作用与药物浓度和作用时间具有依赖性特点。丹参酮Ⅰ对雌激素受体阳性人乳腺癌MCF-7细胞和雌激素受体阴性人乳腺癌MDA-MB-453细胞24 h后的IC50均明显低于12 h的IC50(p<0.05),但相应时间点的两种细胞IC50之间无明显差异(P>0.05)。1.1.2不同浓度丹参酮I处理人乳腺癌细胞48 h后,高浓度(5.0μg/ml)丹参酮Ⅰ组集落形成抑制率显著高于低浓度(2.5μg/ml)丹参酮Ⅰ,且两组间有显著性的统计学差异(P<0.05)。但丹参酮Ⅰ对MCF-7和MDA-MB-453细胞的集落形成抑制率与阳性对照DDP组相比较则无显著性差异(P>0.05)。1.2.丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞凋亡和细胞周期的影响1.2.Ⅰ不同浓度丹参酮Ⅰ处理人乳腺癌细胞48 h后,经特异性的DNA荧光探针(DAPI)标记证实：对照组MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞均表现为完整的核结构、低强度的蓝色荧光,未见典型的凋亡形态特征；高浓度(5.0μg/ml)丹参酮Ⅰ组人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞数目减少,细胞均表现为高强度的蓝色荧光,出现典型的凋亡形态学特征,且效果明显高于低浓度组(2.5μg/ml)。1.2.2不同浓度丹参酮Ⅰ处理人乳腺癌细胞48 h后,Annexin-VFITC/PI双染色结果显示,低浓度丹参酮Ⅰ组细胞凋亡率(14.80±3.34%)和高浓度丹参酮Ⅰ组细胞凋亡率(30.13±4.26%)均明显高于空白对照组(6.78±2.34%),与对照组相比均有统计学差异(P<0.05),且高浓度丹参酮Ⅰ组细胞凋亡率明显高于低浓度丹参酮Ⅰ(P<0.05)(图2-12)。但两种细胞之间凋亡率无显著性差异(P>0.05)。1.2.3不同浓度丹参酮Ⅰ处理人乳腺癌细胞48 h后,流式细胞仪检测DNA含量分布图中,雌激素受体阳性人乳腺癌MCF-7细胞Go/G1期细胞数和G2/M期细胞数逐渐下降,S期细胞数逐渐增加,S期细胞比例从39.42±3.53%上升到51.54±5.71%,两组间有显著性差异(P<0.01),但低剂量丹参酮Ⅰ组与对照组相比,显著无显著性变化；丹参酮Ⅰ作用雌激素受体阴性人乳腺癌MDA-MB-453细胞48 h后,随着S期细胞数逐渐增加,伴随着Go/G1期细胞比例和G2/M期细胞比例逐渐下降,S期细胞比例从40.34±3.81%(对照组)上升到57.46±5.52%(2.5 μg/ml丹参酮Ⅰ)和65.56±6.13%(5 μg/ml丹参酮Ⅰ)。1.2.4不同浓度丹参酮Ⅰ处理人乳腺癌细胞48 h后,计算机图像分析系统显示,随着丹参酮Ⅰ浓度的增加,人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞内细胞周期蛋白E(Cyclin E)和细胞周期蛋白A(cyclin A)蛋白表达量显著增加,而细胞周期蛋白B(Cyclin B)蛋白表达量显著减少,与对照组比较具有统计学意义(P<0.05)；随着丹参酮Ⅰ浓度的增加,人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞内周期素依赖性激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,Cdk2)蛋白表达量明显减少,而P27 Kip1和P21 Cip1蛋白表达量均逐渐增加,与对照组比较具有统计学意义。1.3丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响1.3.1丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响计算机图像分析系统分析目的蛋白条带的灰度值与β-actin比值表明,不同浓度丹参酮Ⅰ作用人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞48 h后,p-Akt蛋白和p-PI3K表达量随着丹参酮Ⅰ浓度的增加而逐渐下降,各处理组p-Akt、p-PI3K和p-mTOR蛋白表达量与对照组相比均有统计学差异(P<0.05),但丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞中总Akt蛋白、总PI3K和总mTOR蛋白表达量的影响无明显变化,与对照组相比均无统计学差异(P>0.05)。1.3.2丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路下游蛋白的影响人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞中Bad, Cytochrome C, Caspase-9和Caspase-3蛋白表达量随着丹参酮Ⅰ浓度的增加而逐渐升高,各处理组Bad,Cytochrome C, Caspase-9和Caspase-3蛋白表达量与对照组相比均有统计学差异(P<0.05),且两组间相应蛋白也具有统计学差异。1.3.3 LY294002干预丹参酮Ⅰ对PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响我们使用PI3K抑制剂LY294002和丹参酮Ⅰ的不同组合分别干预人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞48 h,计算机图像分析系统显示：单独LY294002或低剂量丹参酮Ⅰ降低了MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞中p-Akt、p-PI3K和p-mTOR的蛋白表达(图2-23,图2-24),与空白对照相比均有统计学差异(P<0.05),但两组间无显著性差异(P>0.05)(图2-20)。当LY294002或低剂量丹参酮Ⅰ联合使用时48 h, MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞中p-Akt、p-PI3K和p-mTOR的蛋白表达量明显下降,与单药组相比,均有统计学差异(P<0.05)。2.体内实验2.1动物状态监测各组裸鼠的精神状态、活动、进食饮水情况相对稳定。各组体重下降均不明显,未出现其它明显变化。2.2乳腺癌皮下瘤模型的建立荷瘤裸鼠自皮下接种人乳腺癌MCF-7细胞1周左右,裸鼠左侧肉眼可见皮下有一绿豆大小的结节,表明成功建立人乳腺癌皮下模型。2.3丹参酮Ⅰ对人乳腺癌皮下瘤的影响经药物干预2周时低剂量丹参酮Ⅰ(5mg/kg)组肿瘤抑制率为14.82%,高剂量丹参酮Ⅰ(15mg/kg)组肿瘤抑制率为36.70%；药物干预3周时低剂量丹参酮Ⅰ(5mg/kg)组肿瘤抑制率为22.57%,高剂量丹参酮Ⅰ(15mg/kg)组肿瘤抑制率为56.70%,均明高于正常对照组的肿瘤抑制率(2.2%),具有统计学意义(P<0.05)。在开始治疗12次后,G2组(5mg/kg Tan I组)荷瘤鼠原发肿瘤的平均瘤体重量和对照组(G1)相比无明显差异(p=0.159)；但G3组(15mg/kg Tan I组)荷瘤鼠原发肿瘤的平均瘤体重量和对照组(G1)相比较减轻更明显(p=0.004)。研究结论：1.丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞具有明显抑制增殖作用,呈现出浓度和时间依赖性；2.丹参酮Ⅰ具有明显的抑制人乳腺癌细胞的克隆形成率；3.人乳腺癌MCF-7 (ER+)细胞和MDA-MB-453 (ER-)细胞均被丹参酮Ⅰ阻滞于S期：4.丹参酮Ⅰ通过抑制人乳腺癌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导细胞凋亡；5.丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞荷瘤裸鼠的瘤体具有明显的生长抑制作用,具有浓度和剂量依赖性。6.丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞荷瘤裸鼠无明显毒副作用。