甲型流感病毒(influenza A virus)是最为常见的一种引起高传染性人类疾病的因素,该病毒分布于世界各地,在人类和动物中具高致病率和死亡率。尽管对流感病毒进行了广泛的临床和病理学研究,但我们对于流感的发病机制仍不完全明了。先天性免疫系统通过一类属于Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)家族的受体识别入侵病原体。病毒感染可触发一系列免疫反应能有效限制病毒复制和病毒感染的传播。目前研究发现病毒感染时机体内TLR7表达上调,通过髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)途径发挥先天抗病毒免疫反应,导致共刺激分子的活化和细胞因子的产生,并引发随后的特异性免疫应答;如果该通路活化失控,则会导致大量前炎症介质产生,导致机体的炎症损伤。而在中医学中,认为流感的病机主要是"毒损肺络",为感染性肺损伤,是流感病毒的致炎与机体的抗炎反应过程。玉叶解毒颗粒组方包括玉叶金花、金银花、菊花、野菊花、岗梅、山芝麻、积雪草等,功能清热解毒、辛凉解表、清暑利湿,生津利咽。君药玉叶金花,又名大茶根,为茜草科植物啮状玉叶金花的茎叶,民间常用草药,其味甘,微苦,性凉,具有清热利湿,解毒消肿之功效。临床研究证实,玉叶解毒颗粒对流行性感冒和上呼吸道感染具有良好的治疗作用。本实验室前期实验表明,该药物在体外对多种呼吸道病毒,如鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等都具有良好抑制作用,同时体内也具有显著的抗流感病毒作用。为进一步探索玉叶解毒颗粒及其组方的抗流感病毒作用及其免疫机制,本实验对玉叶解毒颗粒及组方玉叶金花、金银花、菊花、野菊花、岗梅、山芝麻、积雪草等成份进行了细胞水平、鸡胚水平及整体动物中抗流感病毒的药效评价,在确证玉叶金花具有显著抗病毒效果的基础上,以流感病毒经TLR7/MyD88信号通路产生的免疫应答为切入点,利用ELISA、荧光定量PCR、Western blot的现代研究技术,探讨其抗流感病毒作用与TLR通路激活的关系,以期深入揭示玉叶解毒颗粒及其单方抗流感病毒效应的免疫应答信号机制,为研究该中药的作用靶点开拓新的探索途径。研究目的观察玉叶解毒颗粒及玉叶金花体内、外对甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N1)的治疗作用,并以天然免疫中重要的模式识别受体TLR(Toll-like Recpter)为切入点,重点探讨玉叶金花抗病毒作用的分子机制,为中医药的临床应用和进一步实验研究提供理论依据。研究方法1.细胞培养法:以流感病毒感染狗肾传代细胞(MDCK)为载体,观察玉叶解毒颗粒及其组方对流感病毒增殖的抑制作用;MTT法检测受试药对MDCK细胞的半数中毒浓度(TC50);血凝法和细胞病变法(CPE)测定药物体外抑制流感病毒增殖的有效浓度。2.鸡胚法观察药物抗流感病毒作用:分别以预防给药和治疗给药2种方式,经鸡胚尿囊腔将不同浓度的药物注入鸡胚,孵育48h后收取鸡胚尿囊液进行血凝试验来评价药物在鸡胚内的抗病毒效应。3.采用流感病毒性肺损伤模型小鼠观察药物在整体动物中的抗流感病毒作用:观察药物对病毒性肺损伤模型小鼠的死亡保护率、肺指数以及病理形态学的影响来评价药物在小鼠体内的抗流感病毒效应。4.采用ELISA方法观察药物对流感病毒型肺损伤小鼠血清中IL-1 β、TNF-α、IL-6分泌水平的影响。5.应用荧光定量PCR和western-blot技术,观察药物对流感病毒型肺损伤小鼠肺组织中TLR7、MyD88、NF-κB、AP-lmRNA和蛋白表达水平的影响。研究结果1.玉叶解毒颗粒及各单味药在MDCK细胞上的半数毒性浓度TC50分别为:玉叶解毒颗粒及各单味药在MDCK细胞上的半数毒性浓度TC50分别为:玉叶解毒颗粒>5mg/ml、玉叶金花>5mg/ml、金银花>10mg/ml、山芝麻<1.25mg/ml、野菊花>10 mg/ml、菊花>5 mg/ml、积雪草>20 mg/ml、岗梅>20 mg/ml。CPE法和血凝法观察玉叶解毒颗粒及各单味药对MDCK细胞的影响,玉叶解毒颗粒5mg/ml、玉叶金花5mg/ml、金银花5mg/ml、岗梅20mg/ml时的能完全抑制甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N1)致细胞病变,抑制病毒对鸡红细胞的凝集作用,菊花5mg/ml、积雪草20mg/ml时能50%对病毒有抑制作用,山芝麻10mg/ml能够完全一致病毒复制,但是毒性较大,在其无毒浓度1.25mg/ml不能抑制病毒复制。野菊花在最大实验浓度下对病毒复制无抑制作用。2.治疗给药方式中,与病毒对照组比较,玉叶解毒颗粒与玉叶金花各剂量组能显著降低A/FM1/47(H1N1)株尿囊液中的血凝滴度(P<0.01),且具有剂量依赖性,其次,对H3N2病毒的影响作用方面,与病毒对照组比较,玉叶解毒颗粒高剂量组、玉叶金花高、中对血凝滴度有良好的抑制作用(P<0.05)。预防给药方式中,与病毒对照组比较,玉叶解毒颗粒、玉叶金花各剂量组对抑制A/FM1/47(H1N1)病毒增殖有显著性作用,差异有统计学意义(P<0.01),且表现出良好的量效关系。同时,玉叶解毒颗粒与玉叶金花高剂量组相较于病毒组能显著性降低H3N2病毒血凝滴度(P<0.05)。无论治疗或预防给药方式,玉叶解毒颗粒与玉叶金花均不能降低A/PR/8/34病毒在鸡胚尿囊液中的病毒滴度。3.相比病毒对照组,玉叶解毒颗粒各剂量组均能减少小鼠的死亡,改善其生存状况,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且玉叶解毒颗粒高剂量组与利巴韦林组对感染小鼠的保护作用相当(P>0.05);玉叶金花高、中剂量组能降低A/FM1/47(H1N1)流感病毒引起的小鼠死亡率,延长小鼠存活时间,与病毒对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。玉叶解毒颗粒以及玉叶金花各剂量与病毒对照组相比,肺指数值有显著性下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),说明两种药物在此条件下有抑制甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N1)感染小鼠肺指数的作用,而且具有较显著的剂量依赖性。各组药物连续灌胃治疗给药,对肺脏炎性病变程度有所改善,能使肺脏组织中的中性粒细胞、淋巴细胞浸润有所减少;减轻肺泡壁充血,肺泡内脱落上皮细胞减少,肺泡及小气管内渗出物较少,少量肺泡扩张,发生肺泡失代偿甚至融合情况较少。4.与病毒对照组相比,玉叶金花高、中、低剂量组血清中IL-1 β、TNF-α、IL-6水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。提示:通过玉叶金花药物干预后,能够显著的抑制流感病毒肺损伤小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的过量表达,存在一定的量效关系。5.玉叶金花各剂量组能够明显下调小鼠肺组织中TLR7、MyD88、NF-κBmRNA的表达,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),有突出的剂量依赖性,但玉叶金花各剂量组对AP-lmRNA无明显的影响,与病毒对照组比较无统计学差异。玉叶金花高、中剂量组能够明显下调小鼠肺组织中TLR7蛋白表达,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01),而玉叶金花低剂量组对TLR7蛋白表达无明显影响(P>0.05)。玉叶金花各剂量组能够显著下调小鼠肺组织中MyD88、NF-κB的蛋白表达,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01);玉叶金花对AP-1蛋白表达无明显影响,与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:玉叶解毒颗粒以及玉叶金花在细胞水平、鸡胚水平、整体动物中均表现出对甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N 1)的增殖有显著抑制作用,且玉叶金花单味药对血清中细胞因子水平具有调节作用,可显著抑制促炎细胞因子上调,减轻炎性病理损伤,其抗病毒作用机制可能与其抑制TLR7介导的MyD88依赖性信号通路,抑制了NF-κB的表达,从而减少流感病毒感染后炎性细胞因子的产生有关。