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生育力低和不育是哺乳动物繁殖领域普遍存在的问题。子宫作为生殖系统主要器官和胎儿生长发育的重要场所,其功能紊乱引发的胚胎死亡和病理性损伤是制约母体生殖能力的关键因素。包括奶牛子宫在内的哺乳动物组织器官,均受来自其周围的生化和生物力信号的双重刺激,但目前对子宫功能的研究多集中于类固醇类激素等可溶性化学信号对子宫的调节。既往研究表明,生物力是胚胎发育中形态发生、组织结构定义和组织动态平衡维持的主要驱动力,然而关于生物力调节奶牛子宫生殖能力的研究鲜有报道。本研究从整体水平上,系统的解析子宫内环境中生化信号协同生物力对奶牛早期妊娠的维持和对损伤后修复的驱动及其中机制,拓展了对动物生殖性能的理解,有助于改善奶牛生产实际问题,提高养殖效益。此外,它们介导的子宫无疤痕修复机制也对再生医学领域具有重要的借鉴意义。1.本文对GEO公共数据库中奶牛早期妊娠和未孕子宫内膜RNA-seq数据（GSE107891、GSE107891和GSE46274）进行二次挖掘,通过GO分析发现细胞外基质（ECM）成分、细胞-细胞黏附、细胞-ECM黏附等条目发生了显著改变,预示子宫内生物力发生了改变。采集动情期和妊娠期奶牛子宫样本,利用免疫荧光（IF）技术和蛋白质免疫印迹（WB）验证了这一结果,且发现YAP（Yes-associated protein）的蛋白水平和基因水平在妊娠子宫内膜中均显著高表达。IF与免疫组化（IHC）实验观察YAP亚细胞定位发现,妊娠子宫YAP存在核转移现象,并且在奶牛子宫内膜上皮细胞（b EECs）中最为明显。2.为揭示生物力介导妊娠的分子机制,本研究建立了密度梯度模型和ECM刚度模型。对低密度（<40%）、高密度（>80%）、低ECM刚度（1 k Pa）和高ECM刚度（40 k Pa）培养的b EECs进行核浆蛋白分离,发现低密度和高ECM刚度显著增强YAP表达和亚细胞定位核转移,即诱导了YAP活化。另外,敲低经典Hippo-YAP途径上游调节因子LATS 1/2可明显阻断低密度诱导的YAP活化,但无法阻止高ECM刚度对YAP的激活。结果表明,ECM刚度信号传导独立于Hippo通路,但细胞密度信号的传导依赖于Hippo通路。进一步研究发现,F-actin聚合抑制剂Lat.A可阻断细胞密度和ECM刚度对YAP的激活,这表明生物力转导需要F-actin的参与。IFN-τ是反刍动物特有的妊娠识别信号,本研究推测IFN-τ作为特殊的可溶性化学信号,参与对YAP活性的调节。实验结果证实YAP可依浓度依赖性方式被IFN-τ激活,且不改变其磷酸化水平。结合课题组对IFN-τ刺激b EECs后的mi RNA测序数据和生物信息学软件分析,显示YAP是mi R-16a的靶标。双荧光素酶报告实验证实这一结果。通过体外转染mi R-16a模拟物/抑制剂后可干扰IFN-τ诱导的YAP活化,揭示了b EECs中IFN-τ/mi R-16a/YAP这一化学信号传导机制。3.在体外利用ECM刚度、IFN-τ、si YAP和过表达质粒干扰YAP的表达,可知YAP活化诱导b EECs的增殖、促进EMT进程和早期妊娠期间弱炎性环境的建立。基于以上结果,本研究利用模式动物小鼠,建立正常妊娠、假孕、IFN-τ单独干预模型,基于WB、IF等技术,验证了早期妊娠小鼠宫内生物力和IFN-τ诱导YAP的活化。另外,腹腔注射YAP抑制剂Verteporfin（VP）或宫内注射si YAP均可抑制子宫内膜细胞增殖,降低胚胎数量,进而破坏小鼠早期妊娠的建立。4.子宫损伤后的快速修复是维持奶牛繁殖能力和缩短产犊间隔最为关键的因素。为探索上述生物力在子宫损伤后修复的作用,本研究构建了临床常见的损伤模型,根据修复期的形态学指标、组织病理学评分、分子生物学修复标记等标准,为下一步研究界定两种模型的修复时间。结果显示,在连续3次间隔7d宫腔注射的3×LPS模型中,第18 d为修复起始,20 d修复高峰期,22 d修复基本完成。对应的产后修复时间是0 d,5 d,10 d。为探索生物力是否参与损伤后的修复,本研究对公共RNA-seq数据进行整合（GSE111976和GSE40312）,基因集富集分析（GSEA）显示修复期细胞间和细胞-ECM间粘附,ECM成分调控基因异常变化。IF检测上皮极性指标αPKC和E-cadherin、细胞连接指标ZO-1以及F-actin,并辅以体外子宫全组织培养24 h后的面积变化数据,可知生物力参与子宫内膜修复。进一步研究发现,YAP在修复期呈现活化趋势,并且在VP和si RNA干扰YAP活化后明显延长了子宫修复时间。5.为探索修复期生物力转导机制,本研究分离子宫内膜基质细胞（ESCs）作为体外载体。与以往研究不同,本研究发现Rap1a介导了ECM刚度对YAP活化的调控,并且Rho GAPs家族成员ARHGAP35与Rap1a在接种于1 k Pa水凝胶上的ESCs内相结合。敲低ARHGAP35可破坏因低ECM刚度或Rap1a过表达引起的YAP胞质滞留。进一步研究表明,Rho A参与ARHGAP35介导的生物力传导。在体内和体外两个层面上运用Rho A抑制剂C3,Y27632和F-actin抑制剂Lat.A,Cytochalasin B（Cyto.B）,实验结果揭示一条新的生物力信号转导机制,即Rap1a/ARHGAP35/Rho A/F-actin/YAP,干扰该途径的传导直接延长子宫损伤后的修复时间。结论:子宫内膜细胞中YAP响应生物力和化学信号的传导,通过调控子宫损伤后的修复进程和早期妊娠的建立,参与雌性动物生殖力的维持。