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A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是造成人和动物感冒的重要病原,一直是兽医学、病毒学和预防医学等关注的焦点。IAV核输出蛋白(Nuclear Export Protein,NEP)也叫NS2,是由IAV的第8片段通过mRNA可变性剪接后编码。NEP在所有亚型的IAV毒株中高度保守,其主要功能是在病毒复制后期作为接头分子介导v RNPs的出核转运。也有文章报道,NEP能调控聚合酶活力和病毒RNA的复制,然而却没有更多的研究来解释NEP调控聚合酶活力的具体机制。筛选与NEP相互作用的宿主蛋白,一方面可以更多的揭示NEP在病毒复制过程中的生物学功能;另一方面,鉴于NEP氨基酸序列的保守性,挖掘新的生物学功能并阐述分子细节可为抗流感病毒药物的研发提供理论基础。研究表明G蛋白通路抑制因子2(G protein Pathway Suppressor 2,GPS2)通过与病毒蛋白互作,参与并调控乳头瘤病毒和丙肝病毒等基因组的复制。本研究表明GPS2是IAV增殖的抑制因子,它通过抑制PB1和PB2之间的相互作用干扰成熟v RNP的装配,进而抑制病毒基因组RNA的复制过程。此外,IAV NEP与GPS2作用并介导GPS2的核输出,从而激活GPS2蛋白的降解。因此,NEP-GPS2相互作用致弱了GPS2对病毒聚合酶活性的抑制,有利于病毒复制。本论文主要研究内容如下:1.NEP与GPS2互作免疫共沉淀实验结果表明,在瞬时转染过表达条件下IAV NEP蛋白与人源GPS2蛋白发生相互作用,且这种相互作用通过GST-Pull down实验得到证实。在病毒感染A549细胞中,Co-IP实验证实NEP与GPS2之间的相互作用是真实存在的。综合以上实验结果表明,IAV NEP与宿主蛋白GPS2之间存在生物学的相互作用,且这种相互作用是直接的,在流感病毒感染细胞内是真实存在的。2.GPS2抑制IAV的复制在本研究中,siRNA沉默宿主基因GPS2能显著提高细胞培养上清中A型流感病毒WSN/H1N1和DW/H5N1病毒增殖滴度,病毒蛋白NP的合成显著提高;而过表达GPS2的细胞中病毒增殖滴度显著降低,表明GPS2是IAV在细胞上增殖的负调控因子。在进一步的研究中,构建了GPS2敲除的A549细胞系,证实GPS2敲除显著提高病毒增殖滴度。综合以上实验结果表明,GPS2是IAV复制增殖的负调控因子。3.IAV感染促进GPS2蛋白降解在IAV感染细胞中,随着WSN/H1N1或者DW/H5N1感染剂量的增加,细胞中GPS2蛋白水平逐渐降低,而mRNA水平变化不显著,提示病毒感染可能会影响蛋白稳定性。蛋白质半衰期测定实验结果表明病毒感染显著缩短了GPS2蛋白在细胞内的半衰期,且MG132能抑制IAV感染引起的蛋白水平降低。而另一方面,NEP的过表达或者病毒感染均能引起核内GPS2蛋白的出核。进一步的研究表明,病毒感染或者过表达NEP引起的GPS2蛋白的降解与其出核转运相关,LMB处理细胞后能起阻断作用。综合以上实验结果表明,IAV感染促进GPS2蛋白的降解,且这种降解与NEP介导的出核转运相关。4.GPS2抑制IAV聚合酶活性在本实验室建立的WSN/H1N1病毒的聚合酶活性检测系统中考察了GPS2蛋白对聚合酶活力的影响,结果表明在不影响聚合酶亚基蛋白表达的前提下,GPS2的过表达能显著抑制IAV聚合酶活性,且呈剂量依赖性。进一步的研究结果表明,在病毒感染细胞中GPS2能与vRNP组份(PB1、PB2和NP)结合,且能抑制病毒RNA聚合酶Rd Rp组装过程中PB1与PB2间的相互作用,进而影响v RNPs的正常装配。综合以上实验结果表明,GPS2干扰IAV聚合酶的组装,进而抑制聚合酶活性。5.GPS2抑制IAV基因组RNA的合成为了进一步探究GPS2抑制病毒增殖的机制,考察了GPS2对病毒RNA合成的影响。与转染对照siRNA组相比,在A549细胞中沉默GPS2基因能显著增加流感病毒vRNA、cRNA和mRNA的水平;为了排除因复制差异带来的影响,我们考察了IAV感染后一个复制周期内3种病毒RNA水平,进一步证实GPS2抑制流感病毒RNA的合成。为了明确GPS2对流感病毒基因组复制的影响,细胞使用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理后再测定其对3种RNA合成的影响,表明GPS2并不参与流感病毒基因组RNA的初始转录,即mRNA的合成,但沉默GPS2基因能显著抑制基因组的复制,即vRNA和cRNA的合成。综合以上实验结果表明,GPS2抑制IAV基因组RNA复制过程中的RNA合成,而不影响初始转录。6.NEP致弱了GPS2对IAV聚合酶活性的抑制在本研究中,考察了NEP对GPS2介导的流感病毒聚合酶活性抑制作用的影响。在HEK293T细胞中,转染HA-GPS2(100ng)前提下,NEP的过表达会显著影响双荧光素酶的活性,这就表明NEP 100ng的转染剂量能缓解GPS2对聚合酶活性的抑制,当培养基中加入11nM的LMB处理细胞时,聚合酶活力受到显著影响。而使用MG132处理细胞时聚合酶活力改变不显著。综合以上实验结果表明,NEP通过与GPS2相互作用介导GPS2的核输出来致弱GPS2对病毒聚合酶活性的抑制。