论文部分内容阅读
目的1.构建靶向DENN-SV基因的shRNA真核表达载体，并筛选最佳靶点。2.研究DENN-SV基因在人乳腺癌细胞系MCF-7中抗凋亡作用的可能机制。方法1、根据DENN-SV基因序列（基因序列号：AF440103.1）及siRNA靶点设计原则，设计并合成四个靶点序列。通过DNA重组技术将siRNA与pRNAi-U6.1/Neo空载体相连接，转化进入E.coli。扩增该菌株、抽提真核载体、进行酶切并测序鉴定。将重组载体转染进入MCF-7细胞，采用RT-PCR、Western-Blot检测四个载体抑制DENN-SV mRNA的表达效率。2、将方法一中筛选出的含最佳靶点序列的菌株扩增并抽提质粒；将实验分为空白组、空白载体转染组及最佳靶点组。以MTT法检测细胞增殖，绘制生长曲线；将实验分为两组，每组分为空白组、空白载体转染组及最佳靶点组，一组转染后48h给予TRAIL25ng/ml处理4h，另一组不予TRAIL处理。收集细胞，采用流式细胞技术检测细胞凋亡率；采用Elisa法测定细胞裂解液中NF-κB含量；采用EMSA法检测核蛋白样品中NF-κB活性。结果1、载体测序结果与实验设计序列相同，四组载体皆可成功转染进MCF-7细胞中，可见绿色荧光蛋白表达。RT-PCR结果表明：空白组与阴性组间不具有统计学意义；四个实验组（DS-1,DS-2,DS-3,DS-4）与空白组及阴性对照组抑制率间均具有统计学意义（P<0.05），且DS-1组与其余三组亦具有统计学意义（P<0.05）。Western Blot结果示：空白组与阴性组互相不具有统计学意义；四个实验组（DS-1,DS-2,DS-3,DS-4）与空白组及阴性对照组间抑制率均具有统计学意义（P<0.05），且DS-1组与其余三组间亦具有统计学意义（P<0.05）。两者鉴定结果一致，表明在基因转录水平及蛋白水平都可证明，DS-1组抑制效率最佳。2、MTT法表明实验组经转染后细胞的增殖程度显著减少（P<0.05）；流式细胞仪检测TRAIL诱导凋亡效果增强（P<0.05），与空白组、阴性对照组相比较具有统计学意义；Elisa检测NF-κB结果示实验组的NF-κB表达量显著降低（P<0.05）、EMSA检测NF-κB结果示实验组的NF-κB活性减弱（P<0.05）。结论1、本研究应用RNAi技术成功构建了靶向DENN-SV基因的短发夹RNA重组载体,并筛选出最佳靶点为进一步研究该基因抗凋亡机制及乳腺癌的基因治疗奠定了基础。2、本研究干扰DENN-SV基因的表达后，给予TRAIL处理可引起MCF-7细胞的凋亡率增高。这种现象的机制可能与NF-κB活性有关，且该现象与NF-κB的关系与TRAIL的作用没有直接联系。