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本实验以探索抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone, AMH)，卵泡刺激素受体（follicle-stimulatinghormone receptor，FSHR）、黄体生成素受体（luteinizing hormone receptor，LHR）与卵泡发育相关基因在成年羊及羔羊卵巢中的定位及表达特征，以了解这些基因在绵羊卵泡发育的作用。本文通过分子克隆，RT-PCR定量分析及免疫组织化学等方法，对比分析AMH、FSHR和LHR在羔羊和成年羊卵巢卵泡中的表达模式，探讨这些基因在绵羊卵泡发育中的调控机制。实验分为以下四部分：1绵羊AMH基因的克隆、序列分析与原核表达以绵羊卵泡颗粒细胞为材料，提取总RNA，运用同源序列克隆技术，对绵羊AMH基因的cDNA全长进行克隆及序列分析。根据预测AMH蛋白序列将其氨基末端编码260个氨基酸序列亚克隆至pET15b构建原核表达载体，经IPTG诱导重组表达及鉴定。结果表明：获得绵羊AMH基因cDNA全长1797bp（Genbank No. KC986978），开放阅读框为1728bp，预测编码575个氨基酸，N端24个氨基酸为信号肽序列；蛋白分子与牛的同源性高达95.8%。原核表达获得符合预期大小AMH重组蛋白。2绵羔羊卵巢AMH的免疫组织化学分析以成年绵羊和一月龄羔羊卵巢为材料，利用HE染色观察卵巢的结构特征，免疫组织化学分析AMH在卵泡中的表达特征。结果表明：未经外源激素处理的一月龄羔羊卵巢皮质区存在较多的小的同步发育的有腔卵泡。经外源激素处理后的一月龄羔羊卵巢卵泡全部同步发育至大的有腔卵泡。而对外源激素不敏感一月龄羔羊个体，在卵巢皮质部的边缘布满大量的原始卵泡，初级和次级卵泡数量很少，无有腔卵泡。免疫组化显示AMH存在处于生长期的腔前卵泡和小的有腔卵泡，以及卵丘细胞上，在大多原始卵泡上无AMH的表达，而在原始卵泡向初级卵泡转变，外层的颗粒细胞由扁平向柱状转变时AMH有表达。成年羊与羔羊AMH的表达差异？在体外成熟培养后的卵丘细胞中，AMH在羔羊与成年羊中的表达并无差异。AMH可能参与卵泡发育的启动、向促性腺激素依赖期的转变等过程的调控，其功能作用还有待于进一步深入研究。3绵羔羊卵巢中FSHR免疫组织化学分析及FSHR多种剪接形式克隆鉴定利用免疫组化法检测FSHR在绵羔羊卵巢表达分布特征，和RT-PCR技术克隆鉴定FSHR多种剪接形式。结果表明：FSHR在超排羔羊和正常羔羊卵巢主要表达于卵泡颗粒细胞，且在原始卵泡就有阳性信号存在，正常成年羊在原始卵泡没有阳性信号存，在大的优势卵泡中FSHR的表达量降低。获得绵羊6种FSHR多种剪接形式全长编码区的序列，开放阅读框分别是695aa、694aa、648aa、633aa、595aa、533aa。羔羊卵巢中未发现533aa形式，而成年羊未发现694aa和648aa形式。它们可能与卵泡发育进程有关。4绵羔羊卵巢中LHR免疫组织化学分析通过检测LHR蛋白在羔羊和成年羊卵巢的表达变化，为卵泡的生长发育调控奠定理论基础。采用免疫组化法对绵羊卵巢LHR进行定位染色及Western blot检测相关蛋白。LHR主要在正常羔羊和超排羔羊及成年羊在卵巢大的窦状卵泡的颗粒细胞中高表达，超排羔羊LHR的阳性信号表达比成年羊的阳性性号要高。