论文部分内容阅读
本试验以猪体外成熟卵子和冷冻解冻的死精子为材料，探讨了猪ICSI转基因效率的主要影响因素。其中包括注射台温度(30℃，38.5℃)、精子与GFP质粒孵育液温度(4℃，24℃，39℃)、激活后6-DMAP的处理、BSA(牛血清白蛋白)、GFP质粒的浓度及结构(线形和环形)和GFP不同的表达载体，并对绿色荧光胚胎做了PCR检测。
结果表明，注射台温度为30℃时的转基因阳性率为40.07％，而38.5℃时为20.97％，差异极显著(p＜0.01)；但囊胚率差异不显著(p＞0.05)。精子与GFP的孵育温度(4℃，24℃，39℃)对转基因效率和囊胚率的影响不显著(p＞0.05)，但随着孵育温度升高，转基因率有降低的趋势。精子与GFP孵育时，GFP浓度为0.01μg/μl的转基因率(21.13％)比浓度为0.05μg/μl(50.20％)和0.1μg/μl(48.79％)的转基因率低，差异显著(p＜0.05)，但浓度为0.05μg/μl和0.1μg/μl的转基因率没有显著差异，而且3个浓度的囊胚率也没有显著差异(p＞0.05)。环形GFP的转基因率为28.62％，线形的为40.18％，差异显著(p＜0.05)，但二者的囊胚率没有显著差异。pEGFP-N1和pbCASEGFP-LGL的转基因效率和囊胚率都没有显著差异(p＞0.05)。精子与GFP质粒孵育液添加BSA(0.3％)转基因率和囊胚率差异不显著(p＞0.05)；但添加BSA的囊胚转基因率为55.56％，而对照组为33.33％，差异极显著(p＜0.01)。6-DMAP处理组与对照组的转基因率分别为52.53％和26.25％，差异极显著(p＜0.01)；而且6-DMAP处理组的囊胚率(9.96％)显著比对照组(2.30％)高(p＜0.05)。PCR结果显示绿色荧光胚胎的扩增片断长度大概为800bp，与用pEGFP-N1质粒的扩增产物相近，说明这些胚胎携带了EGFP基因。
研究表明注射台温度对转基因效率有明显影响，温度高转基因率低；随着精子与GFP孵育温度的升高，转基因率有降低的趋势，因此在4℃下孵育比较理想。GFP质粒浓度为0.05μg/μl的转基因率和囊胚率比较理想；而线形GFP质粒比环形的更容易在猪胚胎表达；但分子量不同的pEGFP-N1和pbCASEGFP-LGL转基因效率没有明显差别。精子与GFP质粒孵育液添加BSA对转基因胚胎发育有一定促进和保护作用，有利于提高囊胚转基因率；电激活后用6-DMAP处理能提高转基因率和囊胚率。PCR检测结果显示，绿色荧光胚胎明显转染了EGFP。