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草鱼(Ctenopharyngodon idella)是世界上水产养殖产量最高的物种。草鱼养殖易患病,提高草鱼抗病力成为提高成活率的重要手段之一,鱼体抗病能力跟遗传因素相关。Gadd45家族基因是一类重要的DNA损伤修复基因,具有调节细胞周期、参与细胞凋亡和免疫等功能,在草鱼中发现含有五个成员,分别为Gadd45aa、Gadd45ab、Gadd45ba、Gadd45bb和Gadd45g。本文从抗病转录组数据库中筛选出了Gadd45家族这五个基因并克隆其中三个基因,并且筛选Gadd45家族基因五个成员相对应的五个miRNA(miR-731、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-148和miR-429b),研究了他们的结构与功能。论文主要研究结果如下:1.草鱼Gadd45aa、Gadd45ab和Gadd45g等三个基因的登录号分别为KX523186,KX523187和MK829489,开放阅读框分别为474 bp,480 bp和480bp,编码氨基酸分别为157 aa,159 aa和159 aa,分子量分别为17,547Da,17,708Da和17,720 Da,理论等电点分别为4.98,4.45和4.03。通过SMART网站预测草鱼Gadd45aa、Gadd45ab和Gadd45g分别具有90 aa,106 aa和91 aa的核糖体蛋白L7Ae结构域。草鱼Gadd45aa、Gadd45ab和Gadd45g在草鱼12个健康组织和嗜水气单胞菌感染后的6个免疫相关组织均有表达。利用过表达和干扰手段处理三个基因后,三个基因均能激活MAPK信号通路并上调免疫基因il-8,ifn和tnf-a。2.预测得知草鱼Gadd45aa是miR-731靶基因。为验证预测真实性,用嗜水气单胞菌感染CIK细胞后不同时间点同时检测miR-731和草鱼Gadd45aa表达模式,结果发现二者在不同时间点表达趋势相反。miR-731过表达/干扰能够抑制草鱼Gadd45aa表达。双荧光素酶报告基因结果得出野生型(WT)miR-731模拟物对应的荧光素酶活性降低,miR-731突变体(Mut)不受影响,证明草鱼Gadd45aa为miR-731靶基因。在CIK细胞中,过表达miR-731后能够显著抑制6个免疫相关基因(p38,jnk,erk,tnf-a,ifn和il-8)的表达,miR-731抑制剂显著增加6个基因的表达。草鱼Gadd45aa和miR-731过表达后均能诱导CIK细胞凋亡。综上,miR-731能够通过靶向Gadd45aa调控免疫基因的表达,可能调控其靶基因参与细胞凋亡。3.为验证草鱼Gadd45ab为miR-23a-3p和miR-23a-5p靶基因,用miR-23a-3p和miR-23a-5p模拟物转染CIK细胞,q PCR检测Gadd45ab的表达被显著抑制。用miR-23a-3p和miR-23a-5p抑制剂转染的细胞中,Gadd45ab表达显著增加。这些结果表明miR-23a-3p和miR-23a-5p共同调控靶基因Gadd45ab。双荧光素酶报告载体实验进一步验证了Gadd45ab为miR-23a-3p和miR-23a-5p的靶基因。miR-23a-3p过表达显著抑制了jnk、erk、tnf-a和ifn表达,miR-23a-3p抑制剂显著增加p38、erk、tnf-a和ifn表达。miR-23a-5p过表达显著抑制p38、jnk和erk、tnf-a和il-8表达,miR-23a-5p抑制剂显著增加p38、erk、tnf-a和ifn表达。用嗜水气单胞菌感染miRNA的抑制剂后,检测到miRNA表达量均显著降低。根据caspase 3/7实验,结果得出miRNA对细胞凋亡具有抑制作用,其靶基因Gadd45ab能够促进细胞凋亡。草鱼miR-23a-5p和miR-23a-3p均能够通过调控其靶基因来激活免疫相关基因表达及抑制细胞凋亡。4.双荧光素酶报告基因实验以及miRNA-148模拟物/抑制剂对靶基因反向调控,验证得出草鱼Gadd45ba和Gadd45bb均为miR-148靶基因。在嗜水气单胞菌感染CIK细胞不同时间点中,miR-148表达水平发生显著改变,表明miR-148对于细菌侵染具有一定反应。miR-148过表达后,p38,jnk,erk,tnf-a和ifn的表达量显著下降,在miR-148抑制剂组中,p38,jnk,erk,tnf-a和ifn表达水平显著增加。草鱼miR-148对于细菌刺激产生一定反应,miR-148通过与靶基因相互作用调控免疫基因表达。5.鉴定发现草鱼Gadd45g为miR-429b靶基因。miR-429b过表达和抑制对免疫相关基因il-8,ifn和tnf-a的表达具有负调控功能。草鱼miR-429b通过抑制靶基因达到调控免疫基因作用。通过草鱼miRNA与靶基因相互作用,探究二者对抗菌免疫及凋亡功能,结果为草鱼抗病性状遗传机制提供了靶基因,也为miRNA调节草鱼抗菌免疫力研究建立了理论数据基础,为其他水产动物中进行miRNA研究提供了理论参考。