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小鼠的胚胎干细胞起初是于1981年在实验室条件下分离得到的,与此同时建立起了最早的具有全能性的胚胎干细胞系。基于已有的小鼠胚胎干细胞建系方法,科学家先后在多种家畜动物中分离胚胎干细胞并建立相应体系。因胚胎干细胞具有自我更新和全能性的独特生物学性质,无论是在生物发育学角度还是在临床医学研究上均具有非常重要的研究意义。为了更透彻的研究影响胚胎干细胞相关特性的机制,更多的研究者将研究重点集中在如何在体外维持其自我更新状态；如何定向诱导其分化,以便于为临床疾病建立模型。经过大量的实验和数据分析,科学家已探索出能够在体外环境下维持胚胎干细胞自我更新状态的方法。然而胚胎干细胞维持自我更新是一个较为复杂的生物学过程,不同的基因,不同的通路亦或者不同外界条件的影响都会使其状态发生变化。目前对于影响胚胎干细胞的相关基因、通路和调控机制的研究尚不完善,这也阻碍了其在应用上的广泛性。因此借助分子实验技术研究新的基因对于胚胎干细胞的影响,是有利于更全面的了解胚胎干细胞维持自我更新及分化的调控机制。大量报道指出Gadd45g与肿瘤的发生有关,目前已证实其与垂体瘤、睑板腺癌、食管鳞癌、结肠癌等肿瘤细胞形成有关。而我们已经知道,干细胞与肿瘤细胞存在很多相似的生物学特性,因此我们猜想Gadd45g可能对胚胎干细胞也存在一定的作用,到目前为止,尚未有关于该基因在胚胎干细胞中作用机制的报道,所以我们大胆推测该基因可能与胚胎干细胞的增殖有关。我们想要通过该课题探索Gadd45g在小鼠胚胎干细胞中如何调控其自我更新过程,首先需在胚胎干细胞中过量表达该基因,然后借助相关实验软件设计该基因引物并大量扩增。测序验证正确后,在脂质体的协助下将该基因导入46C细胞内进行过表达并验证。当稳定细胞株建立后,充分利用胚胎干细胞的特性,即处于自我更新状态的胚胎干细胞可在碱性磷酸酶染色后着色,然而处于分化状态的胚胎干细胞则无法着色,借此可对细胞状态进行判别。通过阅读大量文献,我们可以筛选出一些具有特殊标志性的基因,如胚胎干细胞维持自我更新的标志性基因Oct4、 Nanog等,通过免疫荧光实验,运用带有染料的二抗来识别相对应的一抗抗体,识别后可以根据显微镜下荧光的相对含量来推断相应蛋白的表达量,从而判定胚胎干细胞是否处于自我更新状态。实验结果证实,在过表达Gadd45g基因后胚胎干细胞的生长速度明显降低且出现了明显的分化状态,说明Gadd45g基因具有抑制胚胎干细胞自我更新,促进其分化的作用。初步断定后,我们想借助一些功能验证实验来探究其作用。首先选择了qPCR实验,通过标志性基因判定细胞状态的同时借助细胞各发育状态的标志性基因的表达量变化来推测Gadd45g可能影响胚胎干细胞发育的具体阶段。我们筛选了Esrrb、Tfcp211(CP2样转录因子1)、Sox17、Gata6、Foxa2、T、Mixl1、GSC、Nestin以及Sox1等标志性基因,结果对比分析可知,过表达Gadd45g后对中内胚层标志性基因的表达量影响较大,由此可以推断Gadd45g对于中内胚层发育阶段的影响较大。为了验证其蛋白的表达量变化,我们还做了Western Blotting实验,因前期报道指出该通路对于LIF/JAK/STAT3信号通路有作用,所以我们也选取了STAT3作为目标蛋白进行验证。通过实验结果分析,过表达Gadd45g的实验组STAT3磷酸化表达量与对照组相比,表达量有明显变化,因此可以推断在胚胎干细胞中Gadd45g基因同样影响了LIF/JAK/STAT3信号通路。之前大量的文献报道,在培养基中加入一些化学小分子对于维持胚胎干细胞自我更新是有一定作用的,而我们实验过程观察到过表达Gadd45g后的胚胎干细胞相对于实验组的生长速度有明显的下降趋势。基于此我们筛选了大量的化学小分子,如CHIR、PD03、ActivinA、 bFGF等,试图寻找到可以抑制Gadd45g对胚胎干细胞作用的化学小分子。经过分条件培养、细胞计数以及碱性磷酸酶染色验证胚胎干细胞状态后,我们筛选到Rho激酶抑制剂(Y-27632),简称Y27,可以抑制Gadd45g对胚胎干细胞的影响。大量实验数据分析得知Gadd45g基因对于小鼠胚胎干细胞的增殖有一定作用,该基因会抑制胚胎干细胞的自我更新,促进其分化；同时实验结果还验证其影响胚胎干细胞中内胚层的发育过程并且调控LIF/JAK/STAT3信号通路。目前还没有针对该基因可以调控胚胎干细胞的相关报道。所以本课题的研究发现了一个抑制胚胎干细胞维持自我更新,促进其分化的全新基因,丰富该基因作用的同时也扩充了胚胎干细胞的研究范围。