论文部分内容阅读
微囊化转NGF基因成纤维细胞治疗周围神经损伤的研究 人们对于周围神经损伤和治疗的研究多年来从未间断过，研究方法也在不断进步和深入。2001年，我科胡昭华与中科院大连化学物理研究所合作，首先开展了大鼠微囊化神经组织／细胞移植促进神经再生的研究，取得了较为肯定的结果。本实验在此基础上，研究微囊化转神经生长因子(NGF)基因的成纤维细胞移植后的存活、NGF分泌及其对周围神经再生的作用，进一步探索治疗外周神经损伤的有效方法。 研究内容和方法：(1)．在克隆出小鼠βNGF的成熟cDNA序列及其前导序列的基础上，采用IL-2信号肽编码序列连入其前导肽序列，构建出分泌型NGF的真核表达质粒pcDNA3.1+／NGF；(2)利用FuGENETM6转染方法将pcDNA3.1+／NGF导入NIH 3T3细胞中，用Western Blot、免疫组化检测细胞转染后NGF蛋白的表达情况，并通过观察转染后细胞培养上清对PC12细胞突起生长的作用来鉴定NGF的活性；(3)将转染后的细胞包裹在海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微胶囊中，体外培养并通过MTT及ELISA定期测定微囊化细胞的生长和NGF分泌；(4)．将微囊化的转NGF基因NIH 3T3细胞移植在大鼠损伤坐骨神经的周围，通过美兰染色、免疫组织化学、电镜技术及电生理、坐骨神经功能指数检测NGF对神经损伤后轴突再生及功能恢复的影响。 结果：1．成功构建分泌型NGF的真核表达质粒pcDNA3.1+／NGF；2.pcDNA3.1+／NGF成功转染NIH 3T3细胞，并检测到NGF蛋白的稳定表达，转染后细胞的培养上清能促进PC12细胞突起生长，提示表达的NGF具有良第四军医大学整形外科硕士学位论文好的生物学活性;3.在观察的70天内，转基因NIH 3T3可在微囊内生长、存活，NGF分泌与囊内细胞的活性保持一致，即在培养的初期(10d以内)NGF分泌随细胞活性的增加而增加，在培养中期(20一50d)，微囊中细胞活性相对稳定，NGF的分泌也保持在一个相对稳定的水平;4.微囊化转基因细胞可在体内存活，用HE染色法观察到微囊化细胞周围炎症反应较轻;美兰染色、免疫组织化学、电镜显示移植微囊化转NGF基因细胞组再生神经纤维数目多，髓鞘厚(P<0.05)，神经纤维丝平行排列，规则有序，走行通畅，再生轴突超微结构恢复正常时间短;从动作电位幅值恢复率、传导速度恢复率及坐骨神经功能指数等功能学指标来看，微囊化转基因细胞表达的NGF能明显改善损伤坐骨神经的功能恢复。 结论:在成功构建真核表达载体PcDNA3 .1+双GF的基础上，将其转染NIH 3T3细胞并获得稳定表达，然后将微囊化转基因细胞进行在体移植，初步证实:1.海藻酸钠一多聚赖氨酸一海藻酸钠(APA)生物微胶囊是进行组织细胞移植的有效的免疫隔离工具;2.微囊化转NGF基因成纤维细胞能在体内长期存活并持续分泌有活性的NGF;3.NGF具有肯定的促进周围神经再生和功能恢复的作用;4.运用NGF基因治疗和微囊技术相结合的方法，是目前治疗外周神经损伤可靠而有效的方法。