由布鲁氏菌(Brucella)引起的布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种重要的人畜共患病。可造成动物流产,人类似流感状的周期性波浪热,严重威胁畜牧业的发展和公共卫生健康。目前,现有的疫苗存在毒力增强、免疫效果差等缺点。而脂多糖作为布鲁氏菌重要的毒力因子,越来越多的研究针对脂多糖基因的敲除获得布鲁氏菌疫苗的备选菌株。为了探索毒力低、免疫效果好的布鲁氏菌疫苗备选菌株,本研究对六大经典布鲁氏菌标准株脂多糖的毒力基因进行同源性比对,筛选出WbdA基因、WbkE基因,进行基因部分缺失,并进行了毒力评价和免疫评价,这为适合新疆本地布鲁氏菌疫苗的研制奠定了基础,也提供了一些可行性依据。目的:(1)构建并鉴定羊种布鲁氏菌新疆流行株WbdA基因、WbkE基因的原核表达以及生物信息学分析,探究WbdA蛋白和WbkE蛋白的功能。(2)构建并鉴定羊种布鲁氏菌新疆流行株ΔWbdA、ΔWbkE缺失株。(3)分析羊种布鲁氏菌新疆流行株ΔWbdA、ΔWbk E缺失株毒力变化。(4)分析羊种布鲁氏菌新疆流行株ΔWbdA、ΔWbkE缺失株对小鼠的免疫水平。方法:(1)克隆、表达、纯化WbdA蛋白、WbkE蛋白,进行Western Blot验证,并利用生物信息软件分析这两种蛋白。(2)以热灭活的羊种布鲁氏菌新疆流行株为模板分别高保真扩增WbdA和WbkE基因的上下同源臂序列,分别采用融合PCR将上下同源臂融合;以枯草芽孢杆菌为模板高保真扩增Sac B蔗糖抗性基因的序列;将上下同源臂融合片段、Sac B基因连接于pGEM-7zf(+),构建重组质粒;将阳性质粒电转入羊种布鲁氏菌感受态细胞,并进行筛选和鉴定。(3)将羊种布鲁氏菌新疆流行株、羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株、羊种布鲁氏菌新疆流行株ΔWbdA、ΔWbkE缺失株分别侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7以及以106 CFU剂量腹腔接种6-8周龄的昆明雄性小鼠,进行毒力评价,后对小鼠血清进行布鲁氏菌虎红平板凝集试验和试管凝集试验。(4)待免疫缺失株的小鼠脾脏布鲁氏菌清除后,使用亲本株进行攻毒试验。将免疫羊种布鲁氏菌新疆流行株、羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株、羊种布鲁氏菌新疆流行株ΔWbdA、ΔWbkE缺失株以及PBS 2周、4周、6周、8周、10周以及攻毒后2周、4周的小鼠血清分别进行小鼠IgG ELISA检测和小鼠IFN-γELISA检测。结果:(1)成功构建了羊种布鲁氏菌新疆流行株WbdA基因和WbkE基因的原核表达载体。生物信息学显示,WbdA蛋白具有一个跨膜结构区,没有信号肽,有20个抗原决定簇,二级结构主要由α-螺旋构成,并利用Phyre2在线软件成功构建了该蛋白的3D模型。同样,生物信息学也显示WbkE蛋白没有跨膜结构区,没有信号肽,有17个抗原决定簇,二级结构主要由α-螺旋构成,并利用Phyre2在线软件成功构建了该蛋白的3D模型。(2)获得了羊种布鲁氏菌新疆流行株ΔWbdA、ΔWbkE缺失株且在15代内稳定遗传未发生回复性突变。(3)在侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7过程中,这两个缺失株在不同时间点CFU计数都与亲本株存在显著性差异(p<0.01);在动物实验中,M5-90组与ΔWbdA组在免疫小鼠10周后脾脏布鲁氏菌被清除,ΔWbkE组毒力几乎没有变化;WbdA蛋白可以作为诊断抗原,鉴别亲本株感染和缺失株免疫的小鼠;虎红平板凝集试验中,ΔWbdA组的小鼠血清不能凝集抗原,说明能区分自然感染和缺失株免疫,而ΔWbk E组的虎红平板凝集试验则不能区分。试管凝集中,羊种布鲁氏菌新疆流行株ΔWbdA缺失株在免疫第十周后,在1:50和1:100稀释度下,不再出现凝集。(4)攻毒后第4周,ΔWbdA组脾脏指数较M5-90组差异不显著,CFU计数较M5-90组差异不显著,而ΔWbkE组脾脏指数较M5-90组差异极显著,CFU计数较M5-90组差异显著。小鼠IgG结果表明,在免疫第2周,羊种布鲁氏菌新疆流行株ΔWbkE组和ΔWbdA组均低于疫苗株组和亲本株组。在免疫2-6周,各组IgG水平基本是逐渐升高的。攻毒后,这二者缺失株组略低于疫苗株组,这表明这二者缺失株组还是具有一定的免疫保护。小鼠IFN-γ结果表明,在免疫第2周时,疫苗株组和两个缺失株组的小鼠血清IFN-γ含量大致相当。在免疫第2-10周时,疫苗株组和ΔWbdA组的小鼠血清IFN-γ含量大致相当。攻毒后,疫苗株组和两个缺失株组的免疫保护相当。结论:(1)成功构建WbdA基因和WbkE基因原核表达载体,利用生物信息学分析对WbdA蛋白和WbkE蛋白的基本性质有了初步了解。(2)羊种布鲁氏菌新疆流行株ΔWbdA、ΔWbk E缺失株均具有良好的遗传稳定性。(3)ΔWbdA缺失株毒力显著降低,ΔWbkE缺失株毒力未见显著下降,ΔWbdA缺失株免疫小鼠血清可区分自然感染和缺失株免疫。(4)羊种布鲁氏菌新疆流行株ΔWbdA、ΔWbkE缺失株免疫小鼠均产生良好的免疫力并且攻毒后,能够具有一定抗强毒能力。