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研究背景及目的：非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD）是目前最常见的慢性肝脏疾病之一，在发达国家成人患病率高达20%-30%，已经成为一个重要的公共健康问题。其发病的关键环节是脂质（尤其是甘油三酯）在肝细胞的异常聚积。任何影响肝细胞脂质摄入、合成、β氧化以及脂蛋白合成等环节的因素均对脂质异常沉积产生影响。最近研究表明肝细胞内源性脂质合成增加在NAFLD发病过程中扮演重要角色。内质网应激（Endoplasmic reticulumstress，ERS）是细胞应对体内外各种刺激的适应性反应，ERS相关的脂肪变和脂肪性肝炎是最近研究的热点，研究发现ERS打破了脂质稳态平衡，诱发肝细胞脂变。固醇调节元件结合蛋白（Sterol regulatoryelement binding protein-1c，SREBP-1c）作为脂质合成的关键转录因子，其活化后启动下游靶基因—脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoAcarboxylase，ACC1）以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（Stearoyl-CoA desaturase1，SCD1）等与脂质合成相关的关键酶，促进甘油三酯合成及脂质沉积。固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein，SCAP）和胰岛素诱导基因（Insulin induced gene，Insig）是位于内质网上的膜蛋白，负责SREBP-1c从胞浆到胞核的转运，在脂质合成的反馈调节中发挥重要作用，维持肝脏脂质代谢平衡。Insig-1/SCAP/SREBP-1c代谢通路的变化对脂质代谢的影响鲜有报道。因此本课题拟通过建立ERS诱导的脂变细胞模型，了解ERS下肝细胞脂质合成代谢的特点，探讨ERS状态下Insig-1/SCAP/SREBP-1c信号通路对肝细胞脂质代谢影响，阐明Insig-1/SCAP/SREBP-1c代谢通路调控脂质代谢的分子机制，为临床防治NAFLD提供新的思路与方法。方法：1内质网应激细胞脂变模型的建立及机制研究1.1内质网应激细胞模型的建立以L02和HepG2两种肝细胞为研究对象，采用不同浓度的毒胡萝卜素（Thapsigargin，Tg）诱导，根据CCK-8法检测细胞存活率，筛选Tg最佳的作用浓度。用最佳作用浓度的Tg体外诱导L02与HepG2肝细胞产生ERS，Western blot检测GRP-78蛋白表达的时间谱，电子显微镜观察细胞内质网形态变化。1.2ERS下肝细胞脂变检测Tg（1μM）作用肝细胞24、48h后通过甘油三酯测定、油红O染色检测细胞内脂质水平。1.3ERS下肝细胞脂变的机制研究采用Real-Time PCR和Western blot方法检测ERS下L02和HepG2肝细胞Insig-1/SCAP/SREBP-1c信号分子及SREBP-1c的上游分子肝X受体（Liver x receptor，LXR）和下游靶基因FAS、ACC1的表达变化。2ERS下肝细胞脂变的Insig-1/SCAP/SREBP-1c信号通路研究2.1过表达Insig-1对ERS状态下肝细胞脂质代谢的影响构建Insig-1的过表达质粒，转染L02与HepG2肝细胞后Westernblot检测DDK标签蛋白的表达；细胞甘油三酯检测了解脂质水平；Western blot检测ERS下SREBP-1c、nSREBP-1c、FAS蛋白的表达。2.2抑制SREBP-1c对ERS下肝细胞脂质代谢的影响构建SREBP-1c基因的干扰质粒，观察抑制SREBP-1c对ERS状态下细胞甘油三酯水平及FAS和ACC1基因表达的影响。结果：1ERS细胞脂变模型的建立及机制研究1.1内质网应激细胞模型的建立与验证通过CCK-8法筛选Tg诱导ERS的最佳浓度。不同浓度（0.5、1、2和4μM）Tg诱导24h后，细胞生长无明显影响；48h后Tg对L02细胞和HepG2细胞的生长抑制率分别为9.25%、9.95%、11.12％、13.22%和6.17%、6.76%、9.98%、14.81%；72h后细胞抑制率过大。选取1μMTg作用24、48h诱导ERS；与对照组相比，Tg作用12h后，GRP-78蛋白表达明显增加（P<0.05），24h、48h其表达逐渐升高，各组之间比较差异均有统计学意义（P<0.05）；透射电镜显示细胞内质网明显扩张。1.2ERS诱导肝细胞脂变Tg（1μM）诱导24h后，L02与HepG2细胞甘油三酯水平未见明显升高（P＞0.05）；48h后，细胞胞浆脂滴明显沉积，甘油三酯水平明显升高（P<0.05）。1.3ERS下肝细胞脂变的机制研究与对照组相比，ERS状态下L02和HepG2肝细胞SCAP、SREBP-1cmRNA和蛋白水平均明显升高（P<0.05），其中nSREBP-1c蛋白升高更明显；SREBP-1c靶基因FAS和ACC1蛋白的表达明显升高（P<0.05）；LXR蛋白的表达无明显变化（P＞0.05）。Insig-1mRNA在L02细胞表达明显升高（P<0.05），而HepG2升高不明显（P＞0.05）；在蛋白水平，两种细胞Insig-1蛋白表达明显降低（P<0.05）。2ERS下肝细胞脂变Insig-1/SCAP/SREBP-1c信号通路的研究2.1过表达Insig-1对ERS状态下肝细胞脂质代谢的影响与空白对照组相比，pCMV6-Insig-1-DDK重组质粒转染组有DDK标签蛋白表达；与Tg组相比，转染pCMV6-Insig-1-DDK重组质粒并Tg作用48后， SREBP-1c前体蛋白的表达无明显变化（P＞0.05），但nSREBP-1c蛋白、FAS蛋白表达明显下调（P<0.05），同时细胞内甘油三酯水平也明显降低（P<0.05）。2.2抑制SREBP-1c对ERS下肝细胞脂质代谢的影响成功构建SREBP-1c的miRNA靶向干扰载体。转染SREBP-1c-1miRNA质粒对SREBP-1c的蛋白表达抑制效果最好（P<0.05）；与对照组相比，转染SREBP-1c-1miRNA质粒后，FAS和ACC1蛋白的表达明显降低（P<0.05），L02和HepG2肝细胞内甘油三酯含量明显降低（P<0.05），细胞内脂滴明显减少。结论：1Thapsigargin诱导L02和HepG2肝细胞产生ERS，并导致肝细胞脂质沉积。2ERS在转录及转录后水平调控SREBP-1c的激活，SREBP-1c及其靶基因FAS、ACC1过表达、Insig-1表达减少参与了ERS介导的脂质代谢异常。3Insig-1/SCAP/SREBP-1c通路是内质网应激下肝细胞脂变的重要机制。