论文部分内容阅读
研究背景结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,40-50%患者首诊时已为转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer,mCRC）,预后不佳。以表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor,EGFR）为靶点的靶向药物成为 mCRC 治疗的重要基石,针对EGFR的IgG1单克隆抗体西妥昔单抗（cetuximab,Cet）是其中最具代表性的药物,能显著延长晚期结直肠癌患者生存。然而,治疗过程中产生的西妥昔单抗耐药问题严重限制了病人的获益。目前已经证实的与西妥昔单抗耐药相关的基因改变包括RAS突变（KRAS及NRAS）、BRAF突变、PI3KCA突变及HER2、MET的扩增等,但仍存在一些耐药患者并未检测出以上这些基因改变,这提示我们西妥昔单抗耐药机制的复杂性,探究其中机制对于结直肠癌的精准靶向治疗具有重要意义。作为西妥昔单抗的直接靶点,EGFR本身的突变在既往研究中未发现对结直肠癌西妥昔单抗的敏感性有明确影响。但近年来数项针对结直肠癌的高通量测序研究鉴定了多个EGFR的新突变类型,并提出这些特殊的突变类型与西妥昔单抗抵抗之间可能存在密切联系。EGFRvⅢ是EGFR胞外段缺失突变体,在约40%的高级别胶质瘤中表达,并且与胶质瘤的恶性转化以及较差的临床预后密切相关。最近的研究发现EGFRvⅢ表达于10%的结直肠癌中,与不良预后及抗EGFR治疗的继发耐药具有潜在相关性。尽管缺失了部分胞外段的EGFRvⅢ仍能与西妥昔单抗结合,但单抗的阻断效果以及EGFRvⅢ下游信号通路存在差异。目前尚未有研究深入探索结直肠癌中EGFRvⅢ突变对西妥昔单抗治疗的影响,对该问题的探讨将有助于进一步揭示EGFR信号在结直肠癌耐药演变中的角色,为筛选目标人群、制定个性化治疗方案提供新思路。大多数抗癌药物以非免疫原性方式杀伤肿瘤细胞。但2011年,Garrido G等人首次报道抗EGFR单抗可以诱导肿瘤特异性细胞毒性T细胞的产生,并提出免疫原性的细胞凋亡在该机制中的关键作用。2016年发表于Nature杂志的研究进一步证实,靶向EGFR的西妥昔单抗和帕尼单抗均能诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）。这两项研究共同揭示了免疫因素是西妥昔单抗发挥疗效的重要环节。基于此,我们在解析EGFRvⅢ诱导西妥昔单抗耐药机制时重点关注了 EGFRvⅢ突变对结直肠癌免疫微环境的影响,并进一步探究EGFRvⅢ肿瘤诱导免疫微环境重塑的主要机制,这对于寻找有效药物靶点、探索靶向治疗联合微环境改造策略的可行性奠定了重要基础。研究方法和结果在本研究中,我们首先根据患者肿瘤组织的免疫组织化学染色分析了EGFRvⅢ在结直肠癌中的表达比例及携带EGFRvⅢ突变肿瘤的患者特征。接着,我们通过EGFRvⅢ特异性探针检测患者外周血循环肿瘤细胞、TCGA数据库分析以及动物实验证实了 EGFRvⅢ结直肠癌对西妥昔单抗治疗反应不佳。但在体外细胞株敏感性检测及裸鼠皮下瘤给药实验中,EGFRwt与EGFRvⅢ肿瘤细胞对西妥昔单抗反应性的差异消失,这提示免疫微环境可能介导EGFRvⅢ对西妥昔单抗的抵抗。因此,我们借助GSVA方法构建的免疫浸润评分对EGFRwt及EGFRvⅢ患者免疫微环境进行评估,同时对比免疫相关基因表达水平,发现EGFRvⅢ可以诱导T细胞浸润减少及功能抑制,于是借助患者肿瘤组织免疫荧光染色及动物皮下瘤浸润T细胞的流式分析对该现象进行验证。进一步,我们纯化人外周血CD8+T细胞,使用经特异成分去除或分子量过滤处理后的肿瘤上清对其进行培养,并借助流式细胞术测定其增殖、活化及杀伤能力,结果显示EGFRvⅢ肿瘤可通过促进免疫抑制分子腺苷在微环境中的积累实现免疫逃逸。在机制层面,一方面,我们通过qPCR、Western blot、流式细胞学检测、免疫荧光染色、试剂盒定量、体外吞噬实验等手段,证实了西妥昔单抗在EGFRvⅢ细胞内通过诱导更强的内质网应激及ICD效应,促进腺苷前体ATP的释放,但无法被DC细胞成功吞噬;我们还进一步通过免疫荧光染色及海马能量代谢实验揭示EGFRvⅢ可能通过线粒体转位影响线粒体代谢,从而调控内质网应激。另一方面,我们利用生物信息学分析及前述分子生物学实验手段,发现EGFRvⅢ细胞可通过促进STAT3的磷酸化及入核,转录上调细胞膜上腺苷代谢酶CD39和CD73的表达,进而驱动ICD效应释放到微环境中的ATP高效转化为腺苷。最后,我们利用小鼠皮下瘤初步探索了联合CD39或CD73小分子抑制剂逆转EGFRvⅢ结直肠癌免疫抑制微环境的有效性。结论本研究首次明确EGFRvⅢ突变可诱导形成腺苷介导的免疫微环境,从而驱动结直肠癌对西妥昔单抗抵抗。在机制上,EGFRvⅢ细胞一方面在西妥昔单抗刺激下发生更高水平内质网应激及ICD,导致ATP释放,另一方面通过STAT3通路上调腺苷代谢酶CD39和CD73表达,促进ATP转换为免疫抑制性的腺苷。靶向腺苷通路与西妥昔单抗的联合策略可以改善EGFRvⅢ突变型结直肠癌的免疫浸润。