来源于桔青霉的核酸酶P1隶属于核酸酶S1/P1家族,其家族成员中的核酸酶P1和核酸酶S1均是单链特异性核酸酶,能够催化单链DNA或RNA生成核苷酸,生成的5’-核苷酸及其衍生物广泛应用于制药、食品和核酸结构的研究中。在生物制药方面,其可用于制造各种生化药物。在食品保健方面,在酵母自溶过程中添加核酸酶P1促进RNA转变为5’-GMP及5’-AMP的速率,这两种物质是制作各种食品调味剂的原料。在核酸研究方面,核酸酶P1的主要功能有促进核酸结构的研究和碱基组成的分析。目前国内核酸酶P1供不应求,核酸酶P1的生产菌主要为桔青霉,而桔青霉生产的核酸酶P1具有纯度不高,杂蛋白过多且有毒素掺杂影响后续的分离纯化等问题。核酸酶P1异源表达的宿主有大肠杆菌和酵母细胞,表达的核酸酶P1活力较低。而本研究在黑曲霉中实现了核酸酶P1的高效重组表达,并将其应用于核苷酸的生产中。本文以一株低蛋白背景的无孢黑曲霉Bdel4（LB3ang02D4,在黑曲霉SH-2菌株基础上敲除了糖化酶glaA、淀粉酶aamA、An05g02100和An12g06930）为宿主菌,构建了不同表达策略的核酸酶P1的黑曲霉表达质粒,转化黑曲霉筛选出了一株核酸酶P1表达最优的转化子,发酵酶液经His亲和层析纯化后,进行了核酸酶P1酶学性质的研究,并探索了其在核苷酸的生产中的应用。主要研究的内容如下:（1）根据Uniprot公布的NP1的蛋白序列,经过密码子优化后人工合成Nuc P1基因。将6xHis标签加在Nuc P1基因的C末端,以用于后续的His亲和层析获得核酸酶P1的纯酶液。构建采用Kexlinker（糖化酶自带的信号肽切割位点）、2A肽、融合蛋白等不同表达策略的核酸酶P1的表达框,基于同源重组原理定点整合核酸酶P1的表达框到黑曲霉基因组糖化酶glaA基因位置、18S rDNA和28S rDNA的多拷贝位置,通过测定转化株的酶活水平筛选出酶活最高的一株黑曲霉转化株Bpnu-18S-2,其发酵至144 h时酶活达到89.2 U/mL。（2）通过His亲和层析纯化重组核酸酶P1菌株产生的发酵液,纯化后核酸酶P1的分子量大小为38kDa,之后用糖苷酶PNGase F去糖基化后得到核酸酶P1大小为30 kDa,与PDB数据库预测的核酸酶P1分子量一致。基于纯化所得的核酸酶P1研究其酶学性质,测定得到重组核酸酶P1反应最适pH为5.3,最适温度为65°C,加入2 mmol/L的Cu²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺能够提高核酸酶P1的酶活,同时也显著提高了核酸酶P1的耐热性,Ni⁺约降低20%酶活力,但却能提高核酸酶P1的耐热性,K⁺、EDTA使核酸酶P1的酶活力约降低40%。将黑曲霉转化株Bpnu-18S-2的发酵上清液加入酵母自溶体系中以提高核苷酸的产量,添加75 U的核酸酶P1可生产出14.13 mg/mL的核苷酸,比不添加核酸酶P1时产生的单位核苷酸的产量提高了4.51 mg/mL。