负载BMP-2基因缓释涂层的PEEK植入材料的制备及成骨性能研究

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目的:本实验通过氮气低温等离子体对医用级生物材料聚醚醚酮(Polyetheretherketone,PEEK)表面进行预处理,形成纳米拓扑形貌,再采用复乳溶剂蒸发法(W/O/W)合成载BMP-2基因的氨基化PLGA微球(PLGA-NH2@pBMP-2),并以聚多巴胺(Polydopamine,PDA)为二次反应平台构建载PLGA-NH2@pBMP-2微球的PEEK缓释植入材料(NPEEK-PDA-(PLGA-NH2@pBMP-2)),评价该植入材料的理化性能,研究NPEEK-PDA-(PLGA-NH2@pBMP-2)支架BMP-2释放效果。通过NPEEK-PDA-(PLGA-NH2@pBMP-2)缓释植入材料与大鼠骨髓间充质干细胞(Rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)的共培养,评价该植入材料的生物相容性和成骨活性,为PEEK在材料植入领域的应用提供新思路。方法:(1)采用化学合成法制备活化羧基末端的PLGA,通过联氨六乙二醇与羧基活化PLGA之间的偶联反应,制备出含有氨基末端的PLGA,以氨基化PLGA为原料,使用W/O/W法制备PLGA-NH2@pBMP-2缓释微球,SEM观察其形貌大小,统计粒径分布,测量载药率和包封率。(2)采用氮气低温等离子体在一定技术参数下对PEEK进行表面预处理(NP),在此基础上将其浸泡于PDA溶液中构建NP-PDA,使用扫描电镜(SEM)观察各组材料的微观形貌,采用原子力显微镜(AFM)观察各组材料表面微观结构并测定粗糙度,水接触角测量仪测定各组材料表面水接触角,使用X射线光电子能谱仪(XPS)分析材料表面元素及化学键的变化。(3)通过迈克尔加成反应和冷冻干燥将PLGA-NH2@pBMP-2缓释微球结合于NP-PDA表面,构建NPEEK-PDA-(PLGA-NH2@pBMP-2)支架,并对表层微观形貌、粗糙度及接触角进行综合分析。将NPEEK-PDA-(PLGA-NH2@pBMP-2)浸没于PBS溶液中,采用基因试剂盒检测溶液中BMP-2基因的含量,绘制BMP-2基因释放与时间关系的曲线。(4)将体外培养的BMSC细胞接种于改性前后的PEEK复合材料表面,通过CCK-8,碱性磷酸酶活性检测,茜素红染色及RT-PCR细胞生物学技术研究NPEEK-PDA-(PLGA-NH2@pBMP-2)植入材料对BMSC细胞增殖、成骨分化的影响。结果:(1)PLGA-NH2@pBMP-2微球呈圆球形,形态完整,粒径均一,90%的微球粒径分布在0.8-5.6μm范围内;载药率和包封率分别为1.6%±0.6%和42.7%±6.9%。(2)氮气低温等离子体处理和PDA涂层修饰的PEEK表面成功构建了纳米拓扑形貌,处理后的各组试件粗糙度有明显增加,水接触角较对照组明显降低,且XPS结果中可以分别观察到氮元素特征峰。NPEEK-PDA-(PLGA-NH2@pBMP-2)在40天内较平稳释放pBMP-2,累计释放量达82%。(3)在NPEEK-PDA-(PLGA-NH2@pBMP-2)支架与rBMSCs的共培养实验中,该支架的细胞粘附,CCK-8检测,碱性磷酸酶活性检测,茜素红染色及RT-PCR检测均取得了理想的结果。结论:成功地合成了粒径均一,形态完整的载BMP-2基因缓释微球并构建了载PLGA-NH2@pBMP-2微球的PEEK缓释植入材料;制备的复合材料具有良好的表面形貌、亲水性、粗糙度和活跃的官能团,为细胞黏附和增殖提供有力的结合位点,且有利于营养物质的运输,细胞新陈代谢;复合材料控释的BMP-2质粒转染细胞后持续有效的产生BMP-2蛋白,促进了干细胞在材料表面的募集和成骨诱导分化,明显改善材料促成骨性能,加速骨修复过程,是一种有潜力的骨组织工程支架材料。
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