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羊痘病毒(Capripoxvirus, CaPV)能引起山羊、绵羊和牛的皮肤、器官表面广泛性结节和水肿,病畜产乳量急剧减少,皮毛品质极大下降,造成巨大经济损失。不同毒株的毒力有较大差异,易感动物的致死率可达10%-58%或75%-100%不等,同时,因感染羊痘病毒造成山羊、绵羊和牛及制品的国际贸易受到限制,致使此病成为重要的经济疾病。羊痘病毒属(Capripoxvirus)由山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)、绵羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)和牛疙瘩皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus, LSDV)组成,它们具有很强的宿主特异性,自然条件下,不会发生交叉感染。SPPV及GTPV呈世界性分布,现在广泛分布于非洲、中东、北欧、地中海各国等,我国近年来在如广西、贵州、黑龙江等地也有发生。1929年赞比亚首次发现牛疙瘩皮肤病(Lumpy skin disease, LSD),随后传入南非、坦桑尼亚、以色列及埃及,目前主要分布在非洲中南部地区,并有向欧洲及亚洲扩散的趋势。传统的病毒学试验和血清学试验虽成本较低、操作简单,但存在耗费时间长、特异性和灵敏度不高等缺陷。随着分子检测技术的发展,PCR及实时荧光PCR也有较广泛的应用,但由于需要实时荧光定量PCR仪等昂贵的仪器设备、操作程序复杂等缺点,不利于现场快速诊断检测。目前,我国尚无LSDV流行的报导,同时也无检测该病的相关研究,因此,建立一种快速灵敏的检测方法,对防止牛疙瘩皮肤病传入和加强我国羊痘病毒的监测具有重要的现实意义。环介导等温扩增方法(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等(2000)发明的一种新型的等温核酸扩增技术。该技术利用设计的两对特殊的内、外引物,特异性识别靶序列上的六个独立区域,利用Bst DNA聚合酶启动循环链置换反应,可以在1h之内,将靶DNA片段扩增109-1010倍。该方法具有简便快速、无需昂贵的扩增设备、高特异性及灵敏度、结果鉴定直观简便等特点,非常适合于基层及现场检疫工作。现已广泛用于如禽流感病毒,沙门氏茵及恶性疟原虫等病毒、细菌及寄生虫性病原体的检测。本文通过分析GenBank中羊痘病毒的保守基因序列,选取末端重复序列(Inverted terminal repeat, ITR)为靶基因,运用在线设计软件Primer Explorer 4.0 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html),设计LAMP引物。利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应进程中的浊度进行实时监控,对不同引物组扩增的起始时间、最大扩增速率、达到最大扩增速率所需时间及进入平台期所需时间等参数进行分析,筛选出对羊痘病毒核酸高效、特异扩增的LAMP引物。针对影响LAMP反应效率的重要参数进行优化,确定CaPV-LAMP检测方法的最优反应体系,并经试验验证引物的特异性和最低检测限。通过采用同一批次和不同批次提取的DNA验证CaPV-LAMP的可重复性,并对不同感染组织进行检测,对开发LAMP法羊痘病毒检测试剂盒进行了初步性探索研究。主要研究成果如下：1、根据上述优化试验,最佳的反应体系为：60 pmol FIP 1μL,60 pmol BIP 1μL,5 pmol F3 1μL,5 pmol B31μL,8 u Bst DNA Polymerase 1μL,2xReaction Mix 12,模板DNA2μL, Calcein 1μL, ddH2O4.5μL,总体积为25μL。优化反应条件为：62℃恒温反应60 mMin；80℃,5 min终止反应。2、灵敏度试验表明,本文建立的LAMP法的灵敏度远远高于OIE推荐的普通PCR法,LAMP最低可检测到10-151TCID50,而PCR法最低检测限量为101.49TCID50。特异性试验未发现非特异性扩增,说明其具有较好的特异性。3、在反应前添加经螯合处理的Calcein,肉眼可直接观察结果。避免了琼脂糖凝胶电泳检测LAMP产物的复杂操作,同时极大减少了浑浊度判断时的误差。4、同一批次DNA和不同批次DNA分别进行LAMP检测,其变异系数(CV%)分别为1.65%、8.66%,符合率为98.35%和91.33%,表明该方法具有较好的稳定。本文建立的CaPV-LAMP检测方法可在1.5 h内完成病毒核酸的提取和LAMP检测全过程,该方法只需水浴锅即可进行检测,具有快速高效、操作简便、成本低廉、设备要求低等特点。不需要昂贵的扩增仪,一台恒温水浴锅60 mMin内即可完成检测,结果判定简单直观,能满足临床样本大批量快速检测的需要。本研究建立的CaPV-LAMP检测方法,为CaPV的早期快速诊断提供了新途径,为CaPV的现场检疫和流行病学监测提供快速灵敏的技术手段。