研究背景:本项目组既往研究显示,芪葛颗粒对胃黏膜及肝损伤具有一定的保护作用,黄芪-葛根可以减轻乙醇对肝脏的损伤,但芪葛颗粒护肝的药理作用未作深入探讨。本研究探讨芪葛颗粒防治大鼠酒精性肝损伤的作用及机制评价。目的:研究芪葛颗粒对乙醇诱导的大鼠酒精性肝损伤的保护作用。通过超高压液相色谱(UPLC-Q-TOF-MS)探讨芪葛颗粒对酒精肝损伤的肝脏、血浆、尿液中内代谢物的影响变化,明确芪葛颗粒护肝的作用机理。方法:1.建立乙醇诱导大鼠(亚急性)酒精性肝损伤模型,将SD大鼠随机分成3组,每组8只,即正常组,模型组,芪葛颗粒组。芪葛颗粒组每日给予芪葛颗粒灌胃,正常组和模型组给予生理盐水灌胃。每天除正常组外,其余各组给药4h后均给予50%乙醇连续7天、乙醇浓度增加至60%连续3天、乙醇浓度增加至70%连续2天、乙醇浓度增加至80%连续2天,共14天。末次灌胃前9h禁食不禁水,予腹腔注射3%戊巴比妥钠,并腹主动脉采血观察乙醇对生化指标结果的影响;取肝组织,称重,取各组肝左叶进行病理HE染色观察组织损伤情况。收集数据进行统计学分析,P值<0.05有统计学意义。2.芪葛颗粒对乙醇诱导的大鼠酒精性肝损伤的保护作用研究。建立乙醇诱导大鼠酒精性肝损伤模型,SD雌性大鼠,SPF级,体重180~220g。随机分成6组,分别为正常组(Normal)、酒精性肝损伤模型组(Model)、水飞蓟素组(Positive control)、低量芪葛颗粒组(LQG)、中量芪葛颗粒组(MQG)、高量芪葛颗粒组(HQG)。每天LQG、MQG、HQG组经口灌胃给予低中高剂量芪葛颗粒。正常组(Normal)和模型组(Mode])给予生理盐水(12ml/kg)灌胃。水飞蓟素组(Positive control)给予0.5%水飞蓟素灌胃。将动物每3天称重,以调整受试样品剂量。除正常组(Normal)外,其余各组在分别灌胃给药4h后均给予50%乙醇连续7天、乙醇浓度增加至60%连续3天、乙醇浓度增加至70%连续2天、乙醇浓度增加至80%连续2天,共14天。每组分别于实验的第7d和14d,予代谢笼收集24h尿液,放入-80℃冰箱冷冻保存。实验结束前9h禁食不禁水,称重,按照100g体重大鼠给予3%戊巴比妥钠0.13ml溶液腹腔注射,并腹主动脉采血,取血4-5ml左右,取肝左叶、浸泡10%福尔马林固定液,待进行病例切片HE染色。取血后室温静置1h,待血液分层,离心取上清,-20°保存,进行各项指标的检测,病理组织学检查及代谢组学分析。3.采用代谢组学UPLC-Q-TOF-MS液质分析方法,寻找乙醇诱导酒精肝损伤模型肝脏、血浆、尿液中的潜在生物标志物。建立基于生物标志物的芪葛颗粒对大鼠酒精性肝损伤模型药效评价系统,确定芪葛颗治疗肝损伤效作用的关键代谢通路。通过MarkerLynx4.1软件,进行数据处理,第一个阶段先通过PCA分析(主成分分析)在模型组与各组代谢谱区别的差异。然后,通过OPLS-DA分析(监督的正交偏最小二乘判别分析),寻找模型筛选差异代谢物,模型组所得到的VIP值(变量权重值)。VIP值超过1的代谢物,说明该代谢物在组间差异中起重要作用。使用t检验中两个独立样品的非参数检验测试差异的显着性,并且将统计学显著性的阈值设定为P<0.05。最终选择VIP>1,且P<0.05的化合物作为标志代谢物。结果:1.大鼠均出现嗜睡等醉酒状态。大鼠肝脏经乙醇刺激后损伤严重,肉眼观察肝脏发现:模型组大鼠肝脏大小较正常组偏大,偏暗红色,无光泽。肝脏湿重和肝指数均值都比其他组均值高。血清肝功能检测AST、ALT和TG较其他组大鼠明显升高。HE染色病理切片结果:提示模型组大鼠肝组织损伤明显,见大量脂肪变性,多数大、小的脂肪泡,肝细胞索排列比较紊乱,肝窦少许淤血和出血,细胞肿胀明显。2.大鼠给予芪葛颗粒后,有少数大鼠出现便溏情况,但是体毛、饮食、精神状态,均较肝损伤模型组有不同程度的改善。芪葛颗粒各剂量组的血清AST、ALT和TG含量均低于肝损模型组,其中的高剂量组与肝损模型对照组的差异具有显著性。HE染色病理切片结果:芪葛颗粒低剂量组,大鼠肝小叶结构未见明显异常,炎性细胞增生及脂肪泡数量较模型组有所减少;芪葛颗粒中剂量组肝细胞偶见散在肝细胞脂肪变性,肿胀程度减轻;芪葛颗粒高剂量组肝细胞排列基本正常,肝脂肪变性、炎症细胞程度均降低,肝组织病理变化程度明显减轻。3.乙醇诱导大鼠酒精性肝损伤模型生物标志物的确认,分析芪葛颗粒对乙醇诱导大鼠酒精性肝损伤模型生物标志物的影响,探讨芪葛颗粒护肝作用机理。(1)肝脏代谢组学的潜在生物标志物,最终获得10种生物标志物,二十二碳六烯酸、磷酸胆碱、乙基葡萄糖醛酸苷、亚油酸、二十二碳五烯酸(22n-6,22n-3)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)(20:3/18:0/17:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)(20:5),作为评价芪葛颗粒对肝损伤模型的干预作用,发现芪葛颗粒对其中7种生物标志物,二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸(22n-6/22n-3)、亚油酸、溶血磷脂酰胆碱(20:3/18:0/17:0)具有调节恢复作用,其中3个生物标志物,溶血磷脂酰胆碱(20:3)、亚油酸、二十二碳五烯酸(22n-6)具有显著调节作用(P<0.05)。芪葛颗粒干预肝损伤模型组大鼠药效作用的关键通路主要为亚油酸代谢通路。(2)血清代谢组学的潜在生物标志物,最终获得27个变量(25种生物标志物),乙基葡萄糖醛酸苷、二十二碳六烯酸、油酸酰胺、21-羟基孕烯醇酮、L-乙酰基肉碱、四氢脱氧皮质醇、二十二碳五烯酸(22n-6)、肾上腺酸、色氨酸、亚麻酸、油酸、5-氢基戊酸、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(16:1/20:1/20:3/16:0/18:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(22:1/16:0/22:6/18:0)、色氨酸,作为评价芪葛颗粒对肝损伤模型的干预作用,发现芪葛颗粒对其中8种生物标志物,溶血磷脂酰胆碱(20:1)、二十二碳六烯酸、四氢脱氧皮质醇、溶血磷脂酰乙醇胺(22:1/16:0)、肾上腺酸、亚麻酸、油酸具有调节恢复作用,其中油酸具有显著调节作用(P<0.05)。芪葛颗粒干预肝损伤模型组大鼠药效作用的关键通路主要为甘油磷脂代谢、色氨酸代谢、花生四烯酸代谢通路。(3)尿液代谢组学的潜在生物标志物,最终获得10个变量(9种生物标志物),脱氧皮质醇、Cervonoyl ethanolamide、17 α-羟基妊娠烯醇酮、16α-羟基妊娠烯醇酮、1H-吲哚-3-基乙酰基-肌-肌醇、7-酮脱氧胆酸、去羟肌苷、3-氨基水杨酸、邻苯三酚-2-O-葡萄糖醛酸盐,作为评价芪葛颗粒对肝损伤模型的干预作用,发现芪葛颗粒对其中6种生物标志物,邻苯三酚-2-O-葡萄糖醛酸盐、脱氧皮质醇、17 α-羟基妊娠烯醇酮、16 α-羟基妊娠烯醇酮、1H-indol-3-ylacetyl-myo-inositol、去羟肌苷具有调节恢复作用,其中4种生物标志物脱氧皮质醇、17 α-羟基妊娠烯醇酮、16 α-羟基妊娠烯醇酮、1H-吲哚-3-基乙酰基-肌-肌醇具有显著调节作用(P<0.05)。芪葛颗粒干预肝损伤模型组大鼠药效作用的关键通路主要为类固醇激素的生物合成通路。结论:1.在乙醇诱导的酒精性肝损伤中,大鼠肝脏组织发生了脂肪变性,肝细胞索排列紊乱,肝窦少许淤血和出血,细胞肿胀明显。血清检测AST、ALT和TG及肝指数显着明显升高,表明造模成功。2.芪葛颗粒可以减轻乙醇导致的肝脏肿大,肝细胞组织的损伤程度,其可以降低血清AST、ALT和TG含量的升高。实验表明芪葛颗粒药物具有保护乙醇诱导的大鼠酒精性肝损伤的作用。3芪葛颗粒对酒精性肝损伤具有调节作用。芪葛颗粒通过调节大鼠肝脏、血清、尿液的潜在生物标志物,其作用机制与亚油酸代谢、甘油磷脂代谢、色氨酸代谢、花生四烯酸代谢、类固醇激素的生物合成代谢等通路有关。将代谢通路进行归类分析,从肝脏及血清中共同存在的代谢通路为甘油磷脂代谢和不饱和脂肪酸的生物合成代谢通路。从血清及尿液中共同存在的代谢通路为类固醇激素生物合成代谢通路。表示酒精性肝损伤大鼠体内脂代谢以及胆汁酸代谢作用失衡。