研究背景高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound,HIFU)作为一种治疗良恶性实体肿瘤的新技术,以其微无创的优点广泛应用于临床。但仍存在治疗时间长、治疗功率高、治疗效率不理想等问题。针对这些问题,纳米粒(Nanoparticles,NPs)在增效、联合治疗和可视化等方面,不断地优化和创新,为提高HIFU治疗肿瘤的效果起到了极大的推动作用。本课题中,我们通过构建一种GSH响应型纳米粒(P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs)用于改变组织声环境,增强空化效应,增效HIFU消融,更好地增强肿瘤治疗效果。目的探讨P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs增效HIFU消融,提高肿瘤治疗效果,有望为临床增效HIFU治疗肿瘤提供一种思路。方法1. 采用酯化反应、硝化反应和纳米沉淀法制备P@BDOX/β-Lapac hone-NO-NPs,对其化学结构、粒径、电位、形貌特征、载药率(Loa ding Capacity,LC)、体外稳定性、药物释放以及一氧化氮(Nitric Ox ide,NO)的产生能力进行检测。2.(1)采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞毒性法检测DOX和β-Lapachone不同比例的双药协同作用,确定最佳的协同比例;检测纳米粒对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs和MDA-MB-231乳腺癌细胞毒性。(2)细胞与不同浓度P@N O-NPs共孵育,在不同时间点取细胞培养液测定NO的含量,孵育24h后用DAF-FM-DA探针与细胞共孵育30 min,收集细胞,采用流式细胞术测定NO的荧光强度;细胞与不同类型纳米粒共孵育4 h后与D CFH-DA探针共孵育30 min,收集细胞,采用流式细胞术测定活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和DOX的荧光强度;(3)细胞与不同类型纳米粒共孵育4 h后,分别用DAF-FM-DA和DCFH-DA探针与细胞共孵育30 min,用Hoechst 33342染核,通过激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)观察细胞内DOX的摄取和分布,ROS和NO产生的能力。3.(1)健康雌性SD大鼠尾静脉注射free DOX、BDOX/β-Lapachon e-NO-NPs和P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs,在不同时间点眼眶取血,血样处理后,用紫外分光光度计(UV-vis)测量DOX/BDOX的浓度,检测血浆药物代谢动力学。(2)健康雌性BALB/c小鼠眼眶取血,提取红细胞后与不同浓度的P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs共孵育4 h,观察红细胞溶血率,检测体内生物安全性。(3)建立裸鼠皮下MDA-MB-231乳腺癌移植瘤模型。当肿瘤体积达到100 mm~3,尾静脉注射free D OX、BDOX/β-Lapachone-NO-NPs和P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs,在注射后15 min和12 h时用低强度聚焦超声辐照肿瘤部位,不同时间点用小动物活体成像仪观察药物在体内的分布和肿瘤靶向累积能力。24 h后处死裸鼠,取主要器官和肿瘤组织观察体外荧光成像,主要器官和肿瘤组织研磨,提取药物后用UV-vis检测DOX浓度。(4)裸鼠尾静脉注射free DOX、BDOX/β-Lapachone-NO-NPs、P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs,在注射后15 min和12 h时用低强度聚焦超声辐照肿瘤部位,24 h后瘤内注射DAF-FM-DA和DCFH-DA探针,注射1.5 h后,处死裸鼠,剥离肿瘤,冰冻切片后用DAPI染核,用CLSM观察ROS/NO的生成和DOX在组织中的分布。4.(1)建立裸鼠皮下乳腺癌移植瘤模型,当肿瘤直径达到1 cm时,尾静脉注射Saline和P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs,在注射后15 m in和12 h后用低强度聚焦超声辐照肿瘤部位,24 h后用JC-200型聚焦超声肿瘤治疗系统选用辐照功率150 W,辐照时间5 s进行肿瘤点消融,观察肿瘤组织的灰度变化,取瘤组织测量消融体积并计算能效因子,肿瘤组织做苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色。(2)48只荷瘤小鼠随机分为8组(n=6):ⅠSaline组,Ⅱfree DOX组,ⅢBDOX-NO-NPs组,ⅣBDOX/β-Lapachone-NO-NPs,ⅤP@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs,ⅥUS+P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs,ⅦHIFU+Saline组,ⅧHIFU+P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs组,观察肿瘤的生长情况和裸鼠生存时间,25天后处死裸鼠,取主要器官和肿瘤组织做HE染色。(3)另一组小鼠同样处理25天后眼眶取血进行血常规和血生化分析,评估纳米粒的体内生物安全性。结果1.(1)核磁共振氢谱(~1H NMR)和傅里叶红外光谱(FTIR)显示Mal-PEG-NO-Glu A载体材料成功合成。(2)P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs平均粒径为118.7±7.2 nm(PDI=0.231±0.02),Zeta电位为1.83±0.6 m V。(3)透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)电镜显示P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs呈球形,形态规则,大小均匀,载药率为10.54%。P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs在含有10%胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中粒径大小无明显变化,具有良好的生理稳定性。(4)在PBS和10 m M谷胱甘肽(glutathione,GS H)的PBS溶液中测量了P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs 48 h的BD OX释放曲线。结果显示在48 h时,在10 m M GSH存在下,释放率达到了82.87%,在PBS溶液中,释放率达到了22.01%,认为P@BD OX/β-Lapachone-NO-NPs具有还原敏感性。(5)体外NO生成测试结果显示NO的产生量与P@NO-NPs浓度和GSH浓度成正比。2.(1)MDA-MB-231乳腺癌细胞毒性结果显示DOX和β-Lapachone比例为8:2时具有最佳的双药协同作用。与对照组相比,P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs组具有最好的肿瘤细胞杀伤作用。纳米粒对人体正常HUVECs细胞无细胞毒性,认为具有良好的生物安全性。(2)体外MDA-MB-231乳腺癌细胞NO含量测试结果显示随着P@NO-NPs浓度以及孵育时间增加,NO的生成量也随之增加,流式结果显示纳米粒与MDA-MB-231乳腺癌细胞共孵育后产生大量ROS。(3)激光共聚焦扫描图像显示,纳米粒能被肿瘤细胞有效摄取,P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs组与对照组相比具有较强的核荧光和ROS荧光。P@NO-NPs的CLSM显示绿色荧光(NO)分布在细胞内,且随着浓度的增加,绿色荧光越强。3.(1)BDOX-NO-NPs和P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs相比free DOX具有良好的血液循环稳定性,增强纳米粒的EPR效应。(2)溶血实验结果表明在整个观察期P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs浓度高达200μg/ml,溶血率仅为3.98%,认为能够保持红细胞的结构完整性,具有良好的生物相容性。(3)小动物活体成像和组织分布表明P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs较其他处理组具有更好的肿瘤靶向累积能力。(4)激光共聚焦扫描成像结果显示纳米粒在肿瘤部位累积并内化进入细胞后,能够产生大量的ROS和NO,在P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs处理组,观察到DOX分布在整个细胞并进入到细胞核。4. P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs能够显著增强HIFU消融效果,消融后灰度差变化显著,肿瘤组织消融体积明显大于Saline组,能效因子小于Saline组。HIFU联合P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs有效抑制了肿瘤细胞的增殖(IRT=99.7%),促进细胞凋亡,显著延长了荷瘤鼠的生存时间。血生化血常规分析结果显示P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs具有良好的生物安全性,避免了游离DOX对主要组织和器官的损伤。结论本研究验证了P@BDOX/β-Lapachone-NO-NPs能增效HIFU消融,为HIFU治疗肿瘤提供了一种新的增效剂;HIFU联合化疗,能更好的治疗肿瘤,为临床治疗肿瘤提供一种新的思路。