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中度嗜盐菌的生存适应范围广,可在0.1%～32.5%的NaCI浓度条件下生长,其中Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+ antiporters, NHAs)在对维持细胞正常的盐浓度和pH稳态等过程中发挥重要作用。本文研究菌株Halomonas sp.19-A是前期从强碱性造纸黑液中分离得到,优势存在于造纸黑液中且对造纸黑液具有突出的处理能力。作为中度嗜盐嗜碱菌,Halomonas sp.19-A具有突出的耐盐碱特性：生长氯化钠浓度范围3%-20%,最适氯化钠浓度为3%；生长pH范围5-12,最适pH为10。对Halomonas sp.19-A进行基因组测序发现,该菌株具有发达的Na+依赖性转运系统,推测其在耐盐耐碱性能中发挥重要作用。本研究以钠离子输出基因缺陷菌株Escherichia coli KNabc(nhaA nhaB-chaA")为宿主,通过功能互补法,从中度嗜盐嗜碱菌Halomonassp.19-A克隆得到3个单亚基Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaDl、nhaD2和nhaP及1个编码7亚基Mrp Na+/H+逆向转运蛋白的基因mrp。其中NhaD1与NhaD2具有72%的同源性,另外,与中度嗜盐盐单胞菌Halomonas elongata、嗜碱菌Alkalimonas amylolytica、Vibrio parahaemolyticus和Vibrio cholera 中的NhaD) NhaD型Na+/H+逆向转运蛋白均具有同源性。nhaP编码的蛋白与Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14和Pseudomonas aeruginosa PAOl中的NhaP同源性最高(46%)。本文基因组注释预测的Mrp序列与来自极端嗜碱菌Bacillus pseudofirmus OF4的M印具有同源性,两者对应亚基的序列一致性依次为：MrpA 37%, MrpB 32%, MrpC 46%, MrpD 48%, MrpE 35%, MipF30%,MrpG 40%。并且同样与来自中性菌B. subtilis168 (Ito etal,1999)的Mrp序列也具有一定的同源性:MipA 35%, MrpB 36%, MrpC 42%, MrpD 40%, MrpE 34%, MrpF 35%, MrpG41%c将基因nhaDl、nhaD2、nhaP和mrp分别异源表达到钠离子输出基因缺陷菌株E. coli KNabc中,进行活性功能鉴定。耐盐性实验表明,Mrp可恢复菌株E. coli KNabc对Na+和Li+的耐受性分别达到500mM和10 mM; NhaD2则将菌株E. coli KNabc对Na+和Li+的耐受能力从完全敏感型分别提高到500 mM和300 mM；将NhaP异源表达到E. coli KNabc后,该菌株可以在LBK培养基里耐受400 mM的Na+; NhaD1对于E. coli KNabc的耐盐性影响不大。耐碱性实验表明,在200 mMNa+胁迫下,E. coli KNabc/pEASYBlunt-mrp在pH 8.5时仍有很强的生长能力；E.coli KNabc/ pEASYBlunt-nhaD2在中性条件下长势十分好,pH 8.0的条件下,也能生长,但是碱性再增强的话,生长现象则完全被抑制。E.coli KNabc/pEASYBlunt-nhaP具有非常明显的pH依赖性,在pH8.5时呈现出相对最强的生长能力,在中性或是更碱性的条件下生长能力丧失。在Li+胁迫下,E.coli KNabc/pEASYBlunt-mrp和E.coli KNabc/pEASYBlunt-nhaD2在中性条件下能很好的生长；在碱性条件pH 8.0时,生长状况良好,但是E.coli KNabc/ pEASYBlunt-mrp的生长则受到一定抑制。NhaP依然很特别,中性和强碱性条件下均对E.coli KNabc的生长没什么影响,而却显著提高了它在pH 8.0时的生长能力。NhaD1未明显提高菌株E.coli KNabc的耐碱性。反转膜活性测定实验表明,M、NhaD2及NhaP具有Na+/H+逆向转运活性和Li+/H+逆向转运活性,NhaD1检测到微弱的Li+/H+逆向转运活性。Mrp和NhaP测得具有显著的K+/H+逆向转运活性。NhaD1和NhaD2在中性条件下,K+/H+交换功能较显著。关于转运活性与pH的关系,经分析可以得出以下结论：(1)Mrp、 NhaD2及NhaP的Na+/H+逆向转运活性具有pH依赖性。在所测pH范围内,Mrp随pH的升高,活性不断增强；NhaD2在pH 7-8.5间具有活性,pH 8.5时转运功能最强；在pH 7.5-8.5范围内能检测到NhaP的排Na+功能,pH 8.5时活性最高。Mrp的Na+/H+逆向转运活性相对较高。(2)Mrp、NhaD2及NhaP具有pH依赖性的Li+/H+逆向转运活性。Mrp和NhaD2最大值均在pH 8时获得；对于NhaP仅在pH 7.5-8.5范围内显示出上升趋势的Li+/H+交换功能。(3)在所给定的pH条件下,均测得Mrp具有K+/H+逆向转运活性,而且随pH的升高,活性逐渐增强,直至pH 8.0达到最强,然后随着pH的升高,活性不断降低。NhaD1和NhaD2在pH 7.0检测到了较显著的K+/H+逆向转运活性。采用qRT-PCR方法,在转录水平上对Mrp、NhaD1、NhaD2及NhaP的表达量进行相对分析。NhaD2在弱碱性(pH 8.0)条件下的表达量最高,碱性(pH 10.5)条件下次之。较之中性条件,NhaD1在碱性条件下的表达量并没有增加,这进一步解释了前边的实验结果：菌株E.coli KNabc/pEASYBlunt-nhaD1没有耐碱性和在碱性条件下对应反转膜未测得有转运K+和Na+活性。随pH的增加,MrpA的表达量亦是逐渐上升。该结果与生长实验和反转膜测定结果是一致的。