花生是一种富含蛋白质的大众化食品,亦是主要过敏性食物之一。随着人们对花生需求量的增加,其引起的过敏患病率也急剧上升,阻碍了食品安全保障工作的开展。花生引起的皮炎、腹泻、过敏性休克甚至死亡等过敏症状,不仅影响着人们的身体健康,而且对人们的心理也造成了严重危害。预防食物过敏,不仅需要国家和政府制定更严格的法律法规,还需检验检疫等部门和相关机构对产品进行更精准的检测。因此,亟待建立一种灵敏、特异的花生过敏原快速检测方法。本研究针对Ara h1基因的高度保守序列(No.AF432231)利用DNAMAN软件设计引物,通过大量试验筛选出了一对适宜的跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)引物,借助染料,建立了可视化SRCA检测花生过敏原Arah1基因的方法,并对该方法进行了评价,试验结果如下:首先,基于凝胶电泳法对反应体系和反应条件进行优化,最终确定为:dNTPs 0.625 mM,MgSO4 3.00 mM,1.25 × ThermoPol Reaction Buffer,0.50μM 正反向引物,3.13 ng/μLDNA模板,0.60 U/μL Bst DNA聚合酶(大片段),无菌去离子水补足体系至20.00 μL,62℃恒温反应55 min。反应结束后,通过凝胶电泳判定结果。在以上反应体系的基础上,加入不同染料,研究不同染料在不同光源和浓度下,对扩增反应液颜色的影响,以及不同染料对检测灵敏度、检测时间的影响。结果显示羟基萘酚蓝(HNB)与SRCA方法结合效果最佳,可较好的实现可视化检测。进而优化了该染料的添加量,结果表明,添加0.8μL HNB效果最佳,阳性为天蓝色,阴性为紫罗兰色,可视化SRCA检测的灵敏度为6.25 × 100 fg/μL,15 min即可判定结果。由此,成功建立了可视化HNB-SRCA检测花生过敏原Arah1基因的方法。通过检测包括5种花生在内的23个不同物种,对该检测方法的特异性进行评价,结果显示,5种花生样品均为阳性结果,其余18个非花生物种样品均为阴性结果,因此,该检测方法具有良好特异性。以冀花4号花生为材料,利用试剂盒法提取其DNA(62.50 ng/μL),进行梯度稀释,通过HNB-SRCA可视化方法对其检测,进行灵敏度分析,并与SRCA、LAMP、PCR检测方法比较。结果表明,该方法的灵敏度为6.25 × 100 fg/μL,SRCA、LAMP、PCR凝胶电泳法的灵敏度分别为 6.25 × 101 fg/μL,6.25 × 102fg/μL,6.25 × 103 fg/μL。HNB-SRCA的灵敏度是SRCA的10倍,是LAMP的100倍,是PCR的1 000倍。采用试剂盒法对花生和大豆粉的二元混合物进行基因组DNA提取,利用HNB-SRCA可视化方法对其过敏原检测,进行检出限分析。结果显示:HNB-SRCA的检出限为0.01%,SRCA的检出限为0.05%,PCR的检出限为0.5%,LAMP检出限为0.05%。HNB-SRCA检出限比SRCA、LAMP凝胶法检出限低5倍,比PCR低50倍。对65份实际样品进行检测,与SN/T 1961.2-2007行业标准的检测结果对比,经计算HNB-SRCA方法的敏感性、符合率和特异性分别为100.00%、95.38%、90.00%。综上所述,本研究建立的可视化HNB-SRCA检测方法,在等温条件下即可实现花生过敏原Ara h1基因的灵敏、特异的快速现场检测,操作简便、成本低、效率高,切实可行,更适合在基层检测机构推广,具有较大的应用潜力。