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Wilson病（Wilson disease,WD）是一种常染色体隐性遗传疾病,由于ATP7B基因突变所致的铜代谢障碍使得过量铜沉积在脑、肝、肾、眼角膜等组织脏器。患者可出现肝损害、神经系统症状、角膜K-F环等临床表现。神经系统症状尤其以震颤、肌张力障碍、吞咽障碍以及扭转痉挛等为主要表现的WD患者的治疗一直是困扰临床医师的难题。本课题组团队在既往的中医临床研究中,根据WD患者早期铜毒内聚、肝胆湿热,中后期虚实夹杂以致肝肾不足、气血亏虚的中医病机特点创立了通腑养髓方。该方在改善脑型患者神经系统症状方面取得了良好疗效,并且在疾病动物模型TX小鼠的神经元保护效应实验中也得到了验证。但是这些组织学水平的研究,尚不能完全阐明通腑养髓方对铜损伤的神经细胞的具体作用机制。自噬（Autophagy）是一种将细胞内损伤的细胞器及错误折叠蛋白质等递呈到溶酶体消化降解,实现物质代谢需要的过程,这种生理机制在肿瘤、神经退行性疾病以及衰老相关疾病等疾病的病理生理过程中发挥着重要作用。在已发现多个自噬通路和重要的调控蛋白中,LKB1-AMPK通路是调控自噬的重要信号通路。有研究发现,铜可通过诱导细胞自噬以及凋亡方式最终引致细胞死亡,进一步的研究则发现铜及多巴胺络合物可诱导大鼠多巴胺能神经元发生细胞自噬,从而导致细胞自噬性凋亡。脑型WD患者的神经影像学提示,大多数脑型WD患者存在基底节区病变的影像学表现,更有研究表明过量铜沉积引致的中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元损伤是WD患者脑损伤的重要病理机制。基于上述理论,本课题组提出一种假设,假设通腑养髓方可以基于LKB1-AMPK通路调控高铜诱导的多巴胺能神经元自噬效应,从而起到了保护多巴胺能神经元的作用。接下来的研究将围绕此假设展开,以期验证。本研究将为中药复方通腑养髓方对于神经细胞保护机制的提供重要的理论依据。目的:1.研究通腑养髓方对高铜诱导的SH-SY5Y细胞的保护效应和自噬效应;2.验证通腑养髓方是否基于LKB1-AMPK通路调控自噬效应从而对SH-SY5Y细胞起到保护作用;方法:1.MTT法检测不同浓度梯度的Cu SO4以及不同作用时间点对SH-SY5Y细胞的生存率的影响,筛选出细胞增殖半抑制率（IC50）,以建立WD神经细胞模型。2.制备含通腑养髓方SD大鼠血清。3.MTT法筛选不同浓度的含通腑养髓方鼠血清作用于WD神经细胞模型SH-SY5Y细胞的最佳保护浓度。4.通过慢病毒转染技术构建SH-SY5Y细胞AMPK基因沉默及过表达稳转株。5.RT-PCR及Western Blot法验证转AMPK基因细胞的构建是否成功。6.分组:（1）第一部分共分三组。正常组:给予10%浓度的空白SD大鼠血清正常培养SH-SY5Y细胞;模型组:培养的SH-SY5Y细胞先给予浓度为10%SD大鼠空白血清,1h后再加入最适浓度的Cu SO4;治疗组:培养的SH-SY5Y细胞先给予浓度为10%含通腑养髓方（TFYSF）SD大鼠血清,1h后再加入最适浓度的Cu SO4。（2）第二部分共分七组。正常组:给予10%浓度的空白SD大鼠血清正常培养SH-SY5Y细胞;模型组:培养的SH-SY5Y细胞先给予浓度为10%空白SD大鼠血清,1h后再加入最适浓度的Cu SO4;治疗组:培养的SH-SY5Y细胞先给予浓度为10%含TFYSF鼠血清,1h后再加入最适浓度的Cu SO4;AMPK基因沉默模型组（AMPK-M）:AMPK-型转基因SH-SY5Y细胞加10%空白SD大鼠血清,1h后再加入最适浓度的Cu SO4;AMPK基因沉默治疗组（AMPK-T）:为AMPK-型转基因SH-SY5Y细胞加10%含TFYSF鼠血清,1h后再加入最适浓度的Cu SO4;AMPK基因过表达模型组（AMPK+M）:为AMPK+型转基因SH-SY5Y细胞加10%空白SD大鼠血清,1h后再加入最适浓度的Cu SO4;AMPK基因过表达治疗组（AMPK+T）:为AMPK+型转基因SH-SY5Y细胞加10%含TFYSF鼠血清,1h后再加入最适浓度的Cu SO4。7.CCK8法检测细胞的存活率。8.乳酸脱氢酶释放实验检测细胞上清液中乳酸脱氢酶LDH释放漏出水平。9.荧光显微镜观察细胞经Calcein-AM/PI染色后的存活及死亡状态。10.流式细胞仪检测细胞DCFH-DA荧光探针染色的活性氧ROS相对表达水平。11.生化-酶标仪法检测细胞超氧化物歧化酶SOD水平。12.透射电镜观察细胞超微结构。13.免疫荧光染色法检测细胞内LC3蛋白的荧光强度。14.Western Blot法检测细胞LC3-Ⅱ蛋白、AMPK蛋白、P-AMPK蛋白、LKB1蛋白、m TOR蛋白的表达水平。结果:1.MTT筛选Cu SO4造模剂量检测示:Cu SO4对SH-SY5Y细胞存活率呈现一定的量效与时效的关系。当Cu SO4剂量增加以及作用时间的延长,细胞存活率呈逐渐下降的趋势（P<0.01）。527μM作用24小时细胞存活率为:49.89±8.2%,接近细胞增殖半抑制率;2.MTT筛选含TFYSF鼠血清给药浓度示:10%浓度的含TFYSF SD大鼠血清对Cu SO4诱导下的SH-SY5Y细胞生存率最高;3.慢病毒转染细胞荧光表达:正常对照组细胞在荧光倒置显微镜下几乎见不到表达;AMPK转基因实验组细胞在荧光倒置显微镜下表达较明显;4.RT-PCR及WB检测转AMPK基因细胞的构建结果:AMPK基因沉默型实验组细胞AMPK基因及AMPK蛋白相对表达量与对照组相比显著下降（P<0.01）;AMPK基因过表达型实验组细胞AMPK基因及AMPK蛋白相对表达量与对照组相比显著提高（P<0.01）;5.CCK8检测细胞生存率:与模型组比,治疗组的细胞生存率显著提高（P<0.01）,AMPK-M组与模型组比差异无统计学意义（P>0.05）,AMPK+M组比模型组细胞生存率高,差异有统计学意义（P<0.05）;与治疗组比,AMPK-T组细胞生存率显著下降（P<0.01）,AMPK+T组比治疗组细胞生存率显著提高（P<0.05）;6.LDH漏出率示:与正常组比较,模型组细胞上清液LDH水平显著高于正常组（P<0.01）;与模型组比较,治疗组细胞上清液LDH漏出水平低于模型组（P<0.05）;AMPK-M组无统计学差异（P>0.05）;AMPK+M组比模型组细胞LDH漏出率降低,（P<0.05）。与治疗组相比,AMPK-T组细胞LDH漏出率显著下降（P<0.01）,AMPK+T组LDH漏出率显著下降（P<0.01）;7.Calcein-AM/PI染色:正常组中细胞形态规则,绿色荧光区域明显多于红色区域,表明活细胞数量明显多于死细胞;模型组中红色荧光区域略多于绿色荧光区域,表明死细胞数量略多于活细胞;治疗组的绿色荧光区域多于红色区域,表明该组中活细胞数量多于死细胞;AMPK-M组红色荧光区域和绿色荧光区域差别不显著,表明死细胞、活细胞数量无差异;AMPK-T组绿色荧光区域略多于红色荧光区域,表明该区域活细胞数量略多于死;AMPK+M组的绿色荧光区域多于红色区域,表明该实验组中活细胞数量多于死细胞。AMPK+T组的绿色荧光区域显著多于红色区域,表明该组视野区域内的活细胞数量明显多于死细胞;8.流式细胞仪检测ROS水平:与正常组相比,模型组细胞ROS水平显著升高（P<0.01）;与模型组细胞ROS水平相比,治疗组细胞的ROS水平显著下降（P<0.01）;AMPK-M组细胞的ROS水平上升（P<0.05）;AMPK+M组细胞的ROS水平显著下降（P<0.01）。与治疗组细胞ROS水平相比,AMPK-T组细胞的ROS水平显著上升（P<0.01）;AMPK+T组细胞的ROS水平无统计学差异（P>0.05）;9.SOD水平测定:与正常组细胞SOD水平相比,模型组细胞SOD水平显著低于正常组（P<0.01）;与模型组细胞比,治疗组细胞SOD水平显著增高（P<0.01）;AMPK-M组细胞SOD水平无差异（P>0.05）;AMPK+M组细胞SOD水平显著升高（P<0.01）。与治疗组相比,AMPK-T组细胞SOD水平显著降低（P<0.01）;AMPK+M组细胞SOD水平与治疗组比差异无统计学意义（P>0.05）;10.透射电镜观察细胞超微结构:正常组细胞内细胞核、线粒体形态结构正常,核膜清晰,在细胞内基本见不到自噬体。模型组细胞内可见大量空泡,细胞核形态不规则,核膜不清晰,线粒体数目减少,线粒体结构不规则且存在空泡化,部分空泡内可见内容物,并有部分线粒体被包裹进囊泡里,细胞内可见较多自噬体。治疗组细胞内细胞核形态结构较规则,核膜不清晰,细胞器较丰富,线粒体略肿胀及自噬体数量明显增多。AMPK-M组细胞内细胞核形态不规则,核膜较清晰,线粒体结构破坏严重且数量较少,部分线粒体存在空泡化,可见少量自噬体。AMPK-T组细胞内细胞核形态不规则,核膜较清晰,线粒体数量较少且结构不完整,自噬体数量较多。AMPK+M组细胞内细胞核形态不规则,核膜较清晰,可见大量形态略肿胀的线粒体,部分线粒体存在空泡化,自噬体数量较多。AMPK+T组细胞细胞核形态较规则,核膜较清晰,可见大量形态略肿胀的线粒体,无空泡现象,自噬体数量较多;11.LC3免疫荧光表达:与正常组相比,模型组细胞的LC3免疫荧光强度显著增高（P<0.01）;与模型组细胞相比,治疗组细胞的LC3免疫荧光强度显著增高（P<0.01）;AMPK-M组细胞的LC3免疫荧光强度显著减低（P<0.01）;AMPK+M组细胞的LC3免疫荧光强度与模型组相比增高（P<0.05）。与治疗组相比,AMPK-T组细胞的LC3免疫荧光强度显著减低（P<0.01）;AMPK+T组细胞的LC3免疫荧光强度差异无统计学意义（P>0.05）;12.WB测定自噬效应蛋白LC3-Ⅱ的表达:与正常组相比,模型组细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著增高（P<0.01）;与模型组细胞相比,治疗组细胞内的LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著增高（P<0.01）;AMPK-M组细胞内的LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著增高（P<0.01）。AMPK+M组细胞内的LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著增高（P<0.01）。与治疗组相比,AMPK-T组细胞内的LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著减低（P<0.01）;AMPK+T组细胞内的LC3-Ⅱ蛋白表达水平无统计学差异（P>0.05）;13.WB检测细胞AMPK蛋白、P-AMPK蛋白、LKB1蛋白、m TOR蛋白的表达水平:与正常组相比,模型组细胞内AMPK、P-AMPK、m TOR、LKB1蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）;治疗组细胞内AMPK、P-AMPK、m TOR、LKB1蛋白表达均水平显著升高（P<0.01）。与模型组相比,治疗组细胞内AMPK、P-AMPK蛋白表达水平显著升高（P<0.01）,m TOR、LKB1蛋白表达水平显著降低;AMPK-M组细胞内AMPK、P-AMPK、m TOR蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,LKB1蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;AMPK+M组细胞内LKB1蛋白表达水平与模型组细胞相比差异无统计学意义（P>0.05）,AMPK蛋白表达水平升高（P<0.05）,P-AMPK蛋白表达水平显著升高（P<0.01）,m TOR蛋白表达水平显著降低（P<0.01）;与治疗组相比,AMPK-T组细胞内AMPK、P-AMPK、m TOR蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,LKB1蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;AMPK+T组细胞内AMPK、P-AMPK、m TOR蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,LKB1蛋白表达水平与治疗组差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.高铜环境可以增强SH-SY5Y细胞氧化应激水平,降低抗氧化作用,通腑养髓方可以显著改变高铜环境下细胞内氧化水平过度的现象;2.高铜环境可以诱导SH-SY5Y细胞发生自噬,但此自噬效应不足以抵抗氧化应激对细胞造成的损伤,通腑养髓方可以提高SH-SY5Y细胞自噬效应以减轻细胞内氧化水平达到对细胞的保护作用;3.AMPK稳转株细胞实验表明通腑养髓方通过调控LKB1-AMPK信号通路进一步激活SH-SY5Y细胞自噬,进而起到了保护SH-SY5Y细胞的作用。