葛花中鸢尾苷抗缺血性脑卒中的活性评价及作用机制研究

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缺血性脑卒中是由脑部血液循环障碍导致大脑功能缺失为特征的疾病,严重威胁患者生命。目前还没有理想的药物能够彻底治疗缺血性脑卒中,因此,开发能够治疗缺血性脑卒中的药物,越来越受到关注。天然药物具有多靶点、毒性小、来源广等优点,从天然产物中筛选抗脑卒中的药物成为研究的热点。葛花是中国传统医学中具有代表性治疗心血管疾病药物,鸢尾苷是其主要有效成分,具有降低血脂、抗动脉粥样硬化等作用。因此,本研究对从葛花中筛选出的具有抗缺血性脑卒中活性的异黄酮类成分鸢尾苷进行活性评价,并对其作用机制进行探讨。1.构建氧糖剥夺/复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)细胞模型进行鸢尾苷抗缺血性脑卒中活性评估及作用机制研究本研究利用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)无糖培养基诱导PC12细胞糖氧剥夺,随后通过复糖、复氧构建OGD/R缺血性脑卒中细胞模型,并通过检测细胞存活率、线粒体膜电位、细胞凋亡等指标进行模型验证。在此模型基础上,对鸢尾苷最适作用浓度进行摸索,确定3.125、6.25、12.5μM的鸢尾苷浓度对细胞无毒性,为后续实验奠定基础。此外,通过观察细胞形态,检测细胞存活率、LDH释放量、细胞内ROS水平、Ca2+含量、MMP、细胞凋亡以及细胞迁移,评价鸢尾苷保护OGD/R损伤的活性。结果表明,鸢尾苷(12.5μM)有效改善细胞形态,显著增强细胞存活率,显著降低LDH释放量、细胞内ROS水平、Ca2+含量,显著增加MMP,降低细胞凋亡,提高细胞迁移率。利用Western Blotting(WB)初步探究了鸢尾苷保护OGD/R的作用机制并利用LY294002(PI3K/AKT信号通路抑制剂)进一步验证,鸢尾苷通过大幅度增加Bcl-2/Bax的比值,实现其抗细胞凋亡的功能,并且这与激活p-AKT、p-m TOR有关,添加LY294002抑制剂后减弱了鸢尾苷的神经保护作用,进一步表明鸢尾苷可通过PI3K/AKT信号通路发挥其神经保护作用。2.葛花中鸢尾苷对大鼠缺血再灌注模型的活性评价及作用机制研究本实验通过构建大鼠脑缺血再灌注的动物模型,并通过神经功能评分、脑梗死体积、胼胝体的病变以及脑组织中SOD活性、MDA含量等指标,在动物水平评价鸢尾苷的抗缺血性脑卒中的活性。鸢尾苷高剂量组(20 mg/kg)降低了脑缺血再灌注大鼠模型神经功能评分,有效减缓其神经功能损伤与胼胝体病变,并且显著减少其脑部梗死体积,脑组织中SOD活性增加和MDA含量减少,表明鸢尾苷在动物水平具有抗缺血性脑卒中的活性。在此基础上,通过WB对Bcl-2、Bax、p-AKT与p-m TOR的蛋白表达量检测,进一步在动物水平验证鸢尾苷抗缺血性脑卒中的作用机制。结果表明,鸢尾苷(20 mg/kg)增加了脑缺血再灌注大鼠脑组织中Bcl-2表达,并降低了Bax蛋白表达量;并且,p-AKT蛋白和p-m TOR蛋白表达量的提高,提示鸢尾苷抗缺血性脑卒中与激活p-AKT蛋白、p-m TOR蛋白表达有关。综上所述,本研究首先从细胞水平上证实鸢尾苷通过PI3K/AKT信号通路发挥神经保护作用,进而从动物水平进一步验证了鸢尾苷抗缺血性脑卒中的活性,其抗缺血性脑卒中的作用机制与激活p-AKT蛋白、p-m TOR蛋白相关。该研究为将鸢尾苷开发成一种新的、安全有效的天然药物提供了科学依据。
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