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中国水产养殖业历史悠久，公元前1142年（殷末周初）就已经有凿池养鱼。20世纪70年代以来，我国养殖业更是取得了长足的发展，养殖水域广阔，养殖技术发展迅速，1982年我国水产养殖产量就达到世界的1/3。但是在水产养殖业逐步向高密度集约化养殖发展的过程中，水污染严重、养殖动植物品质下降等情况也越来越严重。在这种情况下可以实现高密度集约化养殖的污染物零排放的生物絮团技术应运而生。生物絮团技术就是通过向养殖水体中添加有机碳源，人工调控养殖系统微生物的种类和数量，从而起到维持水环境稳定、减少换水量、提高养殖成活率、增加产量和降低饲料系数等作用的一项技术[1]。这项技术是实现养殖周期中少换水甚至不换水最行之有效的手段。但是利用何种微生物，如何更好地利用碳源以及确定添加微生物的种类、数量、频率等都是目前亟待解决的问题。本论文分为四部分：生物絮团内分离的微生物的鉴定是以细菌基因组DNA为模板，利用合成的16S rDNA通用引物，通过PCR技术对7株菌基因组DNA的目的片段进行克隆，将经琼脂糖凝胶电泳检测符合要求的产物送生物公司进行序列测定，测序结果返回后与GenBank数据库收录的16S rDNAs基因序列进行BLAST比对，确定细菌的种类。分离鉴定的七株细菌，分别编号为Bf、J2、J3、7-1、24-1、65、5-1，为革兰氏阳性菌，其16S rDNAs序列在GenBank中的收录号依次为HQ285922.1、GQ280023.1、HQ647257.1、JN210568.1、JF411285.1、FJ435214.1、JN082265.1．Bf菌株的16S rDNA序列与Bacillus firmus（坚强芽孢杆菌）序列同源性达到100%；J2菌株与Bacillus licheniformis（地衣芽孢杆菌）序列同源性为99%；J3菌株与Bacillus subtilis （枯草芽孢杆菌）序列同源性为99%；7-1菌株与Bacillusbaekryungensi（s白翎芽孢杆菌）序列同源性为98%；24-1菌株与Bacillus aquimaris（海水芽孢杆菌）序列同源性为99%；65菌株与Bacillus cereus（蜡样芽孢杆菌）序列同源性为99%；5-1菌株与Bacillus pumilus（短小芽孢杆菌）序列同源性为97%。初步鉴定7株菌均为芽孢杆菌属。两株芽孢杆菌兔源多克隆抗体的制备及纯化是将J2（地衣芽孢杆菌）和J3（枯草芽孢杆菌）灭活后离心，沉淀即为失活的菌体，用超滤管对上清进行高速离心后获得。以菌体和胞外蛋白的混合物为抗原，混合弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂多次注射至兔皮下，经过一个免疫周期后取血制备抗血清（该步骤交由金斯瑞生物公司完成）。抗血清送回后利用间接ELISA法测定抗血清效价，J2（地衣芽孢杆菌）进行效价测定时包被的菌浓度是108个/mL，包被抗原100μL/孔，测得抗体效价达到1：256000，J3（枯草芽孢杆菌）进行效价测定是包被的菌浓度是107个/mL，包被抗原100μL/孔，测得抗体效价达到1：128000。用填有ProteinA-SepHarose CL-4B的亲和层析柱对抗血清进行抗体纯化，纯化所得抗体进行SDS-PAGE电泳检测，从凝胶成像仪拍得的照片中可以看出，1、2泳道中可以清楚的看到大小分别为50KD左右和25KD左右的条带，且含量很高，其大小分别与抗体重链和轻链大小相吻合，其他条带含量较少，纯化效果满足实验要求。第3泳道中可以看到蛋白含量很低，合并洗脱液时将其舍弃。联袂亲和素标记的量子点（QDs-SA）免疫标记芽孢杆菌方法的建立是利用纯化所得的抗体（一抗）和二抗（生物素化的羊抗兔IgG）为纽带使菌体与链霉亲和素标记的量子点（QDs-SA）特异性结合，形成“芽孢杆菌-一抗（兔源多克隆抗体）-二抗（生物素化羊抗兔IgG）-链霉亲和素标记的量子点（QDs-SA）”的体系。通过荧光酶标仪和流式细胞仪对标记后体系荧光强度的检测，荧光酶标仪检测结果显示纯量子点荧光强度比较高，且在605nm处有最大荧光强度，100μL量子点（1：100稀释）最大相对荧光强度能达到接近30，50μL量子点（1：100稀释）最大相对荧光强度能达到接近10。在量子点加入量为100μL的条件下，菌浓度分别为108、107、106cfu/mL时最大荧光强度分别为2.9、2.4、1.5。通过荧光强度可以判断出量子点与细菌结合效率不到10%。另外在菌浓度同为108cfu/mL时，量子点加入量分别为100μL和50μL时最大荧光强度分别在2.5和1.5左右。综合可见，量子点与菌体结合的效率只有不到10%。利用流式细胞仪检测280nm激发光激发下，收集发射红光、橙光、绿光的颗粒的大小及数量，根据量子点大小在10nm以内，而量子点连接至菌体后总大小在100nm-200nm之间，可以求出连接至菌体的量子点占量子点总数的百分比。空白对照组中大小符合要求的颗粒只占0.26%，即量子点中达到75nm以上的只占0.26%，可忽略不计。阴性对照组中大小符合要求的颗粒只占1.34%，即能直接与菌结合的量子点占1.08%。阳性对照组中大小符合要求的颗粒占10.66%，即能通过抗体与细菌结合的量子点占9.32%。这些结果都说明量子点标记芽孢杆菌的效率非常低，只有不到10%的量子点标记到了芽孢杆菌上；并且增加菌浓度、抗体用量、量子点用量对提高量子点利用率没有明显的效果，改变量子点用量对其利用率影响亦不明显。芽孢杆菌不同发酵物中活菌高通量计数法的建立是将菌悬液进行梯度稀释后进行恒温培养，24h内每2h测定一次菌液的OD600值，对这些数据汇总后进行拟合，根据拟合方程y=A2+（A1-A2）/（1+exp（（x-x0）/dx））及每组对应的参数求出各浓度菌液培养至OD600=0.2时所需时间，进而建立初始菌浓度与恒温培养菌液至其OD600=0.2所需时间之间的标准曲线并获得标准曲线方程为y=-2.3504x+28.744，（x-初始菌浓度对数值，y-培养时间），R2=0.9994。R2=0.9994说明初始菌浓度对数值与培养时间存在良好的线性关系。为验证这一标准曲线是否适用于发酵培养计数，在通过计算得知初始菌浓度为1.258×107cfu/mL的前提下，通过与建立标准曲线步骤相同的操作后，计算出恒温培养菌液至其OD600=0.2所需时间，利用标准曲线方程推得8种发酵培养基中菌浓度分别为A1.49E+07、B1.82E+07、C1.36E+07、D1.78E+07、E1.23E+07、F1.31E+07、G3.54E+06、H5.34E+06，前6组计算值与已知菌浓度基本吻合，后两组计算值偏小，猜测可能是碳源为乙酸钠引起的。