麻欠精油对脂多糖刺激的THp-1细胞炎症反应以及氧化应激的影响

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麻欠(Zanthoxylum myriacanthum var.pubescens Huang),又名毛大叶臭花椒,为芸香科花椒属植物。因麻欠果实具有特殊的柠檬香气,西双版纳地区少数民族居民将其成熟的果实大量用于烧烤、煲汤、腌肉等食品的加工。此外,西双版纳傣族居民也将其成熟的果实采集入药,用于通气除寒,解毒,消肿止痛,毒虫咬伤,疥疮,以及肠道疾病等多种疾病的治疗。  麻欠精油是从麻欠的果实中经水蒸馏法提取获得。GC-MS和GC-FID分析显示其含有D-柠檬烯、α/β-水芹烯(α/β-Phellandrene)、α/β-蒎烯(α/β-Pinene)、β-罗勒烯(β-Ocimene)及邻伞花烃(o-Cymene)等主要成分,其中D-柠檬烯的含量最高。许多研究表明柠檬烯具有良好的抗炎及抗氧化作用,蒎烯和罗勒烯也有抗炎功效,同时本实验室前期研究显示麻欠果实精油在LPS刺激的RAW264.7细胞上有抗炎效果,但是麻欠精油在人单核THP-1细胞上抗炎及抗氧化作用还不清楚。而THP-1细胞属于人单核细胞系,是一种广泛用于研究天然产物的抗炎和抗氧化作用的细胞模型。因此,本研究的目的是利用LPS刺激的THP-1细胞模型研究麻欠精油的抗炎和抗氧化作用。  首先,建立了THP-1细胞研究平台,在本实验室实现了THP-1细胞的稳定培养、传代及冻存。在此基础上,首先利用LPS刺激的THP-1细胞炎症模型研究了麻欠精油的抗炎效果。处于对数增长期的THP-1细胞用麻欠精油处理后,再用LPS刺激培养24小时,收集上清,用酶联吸附免疫沉淀(ELISA)方法检测炎症因子TNF-α和IL-1β的水平。另外,细胞培养4小时后,用TRIZOL方法提取总RNA,转录为cDNA,然后进行实时定量PCR(RT-PCR)分析TNF-α和IL-1β的mRNA水平。收集细胞,用流式细胞仪检测TLR4的表达水平。裂解的细胞提取蛋白后用Western Blot的方法分析NF-κB通路激酶p-IKK的表达。结果发现,麻欠精油对LPS诱导的THP-1细胞炎症因子TNF-α和IL-1β有显著的抑制作用,同时下调TNF-α和IL-1β mRNA的水平。麻欠精油显著抑制LPS刺激导致的细胞表面受体TLR4表达的增加以及细胞内p-IKK的增加。结果表明,麻欠精油至少是通过抑制LPS激活的NF-κB信号通路抑制炎症因子及其基因的表达和减低细胞表面TLR4受体水平来抑制炎症反应。其它通路也有可能被抑制,如ERK,MAPK等,有待后续研究。  其次,本研究探讨了麻欠精油对脂多糖(LPS)诱导的THP-1细胞氧化应激的影响。麻欠精油处理的THP-1细胞用LPS培养24小时后,用流式细胞仪检测细胞内活性氧和细胞凋亡;用比色法检测总超氧化物歧化酶(SOD);用Western Blot法检测NADPH氧化酶胞质亚基p47 phox的表达。另外,以PMA培养THP-1细胞24小时,使其分化为巨噬细胞,用麻欠精油预处理后,再用LPS刺激培养24小时。收集上清,用Griess试剂测定NO。结果发现,麻欠精油处理组与溶剂对照组相比,LPS诱导的ROS和NO水平显著降低、SOD水平显著增加、NADPH氧化酶胞质亚基p47 phox蛋白表达显著减低,细胞凋亡显著降低。这些结果表明麻欠精油对LPS诱导的THP-1细胞的氧化应激有明显缓解作用并对细胞凋亡有保护作用。  最后是对麻欠精油其他方面活性的初步探索。主要包括麻欠精油对棕榈酸诱导的NLRP3炎症小体的影响以及高糖培养对THP-1细胞炎症反应的影响,主要检测ROS和细胞炎症因子IL-1β的表达水平。但结果不太理想,仍然需要实验探索。  总之,通过以上对麻欠精油在LPS刺激的THP-1细胞上抗炎和抗氧化作用的研究,发现麻欠精油具有优异的抗炎和抗氧化作用。这一研究结果表明麻欠精油在开发针对以炎症和氧化应激为基础的多种疾病的药物或者保健食品方面具有巨大潜力,但还需要更多的动物实验和人体研究检测出其有效成分及作用机理。
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