盐生海芦笋及其内生真菌Salicorn-5次级代谢产物研究

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研究表明,植物内生真菌能产生与寄主植物相同或相似的成分,这为天然抗癌药物和抗氧化剂的生产开辟了新的途径。此外,极端环境中的植物内生真菌,如嗜盐菌,由于独特的代谢途径和遗传方式,使其能够产生许多结构新颖且具有独特生理活性的次级代谢产物,在生物医药、功能性食品、化学化工等领域具有重要应用。本研究以野生海芦笋为原料,利用甲醇提取得到粗提物,分离鉴定其中的化合物,并分离鉴定海芦笋内生真菌、优化发酵条件、分离鉴定发酵产物中的化合物,初步评价了所获得化合物的抗氧化与抗肿瘤活性,具体研究结果和内容如下:通过多种分离纯化手段(硅胶柱层析、凝胶层析、薄层层析、高效液相色谱等)从海芦笋甲醇粗提物中共分离到9个单体化合物,利用1D和2D核磁共振(1H NMR,13C NMR,1H-1HCOSY,HSQC, HMBC)、红外IR、紫外UV和质谱MS等现代波谱技术及相关文献检索,鉴定单体化合物的化学结构,其中化合物Bigelovii C (3)和D(4)为新化合物,7个已知化合物分别为:8-羟基-9-十六烯酸甲酯(1),7-羟基-6-甲氧基香豆素(东茛菪内酯)(2),齐墩果酸(5),丝石竹皂苷元(6),脱镁叶绿素a(7),15a-羟基-脱镁叶绿素a(8)和卟啉二甲酯(9)。采用PDA平板法和斜面法对盐生海芦笋内生真菌进行分离纯化得到菌株Salicorn-5,通过分子生物学方法并结合形态学分析其鉴定为小克银汉霉属(Cunninghamella sp.)。并以抗氧化活性为指标,采用响应曲面法对菌株Salicorn-5发酵条件进行优化,其优化后的最佳培养基配方为:16 g·L-1酵母膏,17 g·L-1蛋白胨,300 g·L-1土豆,30 g·L-1麦芽糖,30 g·L-1甘露醇,5 g·L-1葡萄糖,10 g·L-1味精,10 g·L-1氯化钠,pH为7;采用此培养基所得发酵产物对DPPH的最大清除率为78.25%,比优化前(清除率66.55%)有显著提高。采用最佳培养基配方对菌株Salicorn-5进行大量发酵,通过溶剂萃取、柱层析分离纯化、波谱学手段鉴定了9个单体化合物的化学结构,分别为:油酸(10),亚油酸(11),γ-亚麻酸(12),3-油酸单甘油酯(13),硬脂酸甘油酯(14),β-谷甾醇(15),1,3-二油酸甘油酯(16),1,2-二油酸甘油酯(17),过氧化麦角甾醇(18)。采用总抗氧化法(FRAP值)与DPPH法对分离得到的18个单体化合物进行抗氧化活性初步评价。结果表明:化合物2、3、4、7、8和9具有较强的抗氧化活性,其中7-羟基-6-甲氧基香豆素(东茛菪内酯)(2)的活性最强,在1 mM浓度下,其FRAP值与DPPH自由基清除率分别达到255.08 mmol/100 g和88.41%,均与阳性对照Vc相接近。其次是卟啉二甲酯(9),FRAP值与DPPH自由基清除率分别为95.79 mmol/100 g和75.33%。初步推断化合物结构中的双键、羟基等可能是发挥抗氧化作用的主要活性官能团。利用MTT法对抗氧化活性相对较强的6个化合物进行抗肿瘤活性评价,实验结果表明:脱镁叶绿素a(7)具有较强的抗肿瘤活性,浓度为50μM时,对人肺癌细胞A549和人肝癌细胞hepG2的增殖抑制率达到88.68%和81.12%,且高于阳性对照药物依托泊苷(Etoposide),其IC50分别为6.15和17.56μM;其次为化合物Bigelovii C(3),浓度为501μM时,对A549细胞的增殖抑制率为48.49%,具有中等的抗肿瘤活性。
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