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目的：
1.体外培养人肝肿瘤细胞HepG2细胞系。
2.研究胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)及其类似物Exendin-4对HepG2细胞糖异生作用的影响并探讨其作用机制-PI3K(phosphatidylinositol3kinase)通路。
3.为GLP-1及其类似物有效的降糖、更有针对性地改善糖代谢，为临床治疗提供初步的理论依据。
方法：
1.体外培养人肝肿瘤细胞HepG2细胞系，通过倒置显微镜形态学观察。
2.将培养的HepG2细胞随机分为4个干预组，每组五个样本，四组分别为Control组，insulin(INS)(10nmol/L)干预组，GLP-1(10nmol/L)干预组，Exendin-4(10nmol/L)干预组，各组的五个样本分别干预0h，4h，8h，16h，24h五个时间点，提取细胞总蛋白，检测磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenol pyruvate carboxy kinase，PEPCK)的蛋白表达量，描绘出PEPCK表达随时间变化的趋势曲线，选取合适的药物干预时间，作为药物的最终干预时间。
3.将培养的HepG2细胞随机分为9组：①Control组，②INS(10mol/L)组，③GLP-1(10nmol/L)组，④Exendin-4(10nmol/L)组，⑤GLP-1(10nmol/L)+INS(10nmol/L)组，⑥Exendin-4(10nmol/L)+INS(10nmol/L)组，⑦LY294002(15μmol/L)组，⑧GLP-1(10nmol/L)+LY294002(15μmol/L)组，⑨Exendin-4(10nmol/L)+LY294002(15μmol/L)组，分别干预上述时间后，用蛋白质印迹(western blot)法测定各组PEPCK蛋白的表达量。
结果：
1.人肝肿瘤细胞HepG2细胞系的传代培养情况良好。
2.各实验组INS(10nmogL)组，GLP-1(10nmol/L)组，Exendin-4(10nmol/L)组，GLP-1(10nmol/L)+INS(10nmol/L)组，Exendin-4(10nmol/L)+INS(10nmol/L)组，LY294002(15μmol/L)组，GLP-1(10nmol/L)+LY294002(15μmol/L)组，Exendin-4(10nmol/L)+LY294002(15μmol/L)组，与对照组相比，HepG2细胞的形态未见明显改变，药物干预24h内对照组与各药物干预组细胞形态完好。
3.蛋白印记法测对照组及各药物干预组在不同时间点的PEPCK表达量，发现Control组，4hPEPCK蛋白表达明显上升，16h后曲线变化趋于平稳；INS、GLP-1、Exendin-4组在8hPEPCK的蛋白表达量与同组4h比较明显减少，8h后PEPCK蛋白表达曲线趋于平稳，变化幅度不明显，故选取8h作为药物最佳干预时间。
4.对照组以及8个实验组在不同药物以一定浓度干预8h后western blot结果表明：
(1)与Control组相比，GLP-1组(10nmol/L)、INS组(10nmol/L)、Exendin-4(10nmol/L)组的PEPCK的表达量均明显减少(p<0.05)，表明INS、GLP-1、Exendin--4能降低HepG2细胞中PEPCK的蛋白表达量；
(2)与INS(10nmol/L)组相比，GLP-1(10nmol/L)+INS(10nmol/L)组、Exendin--4(10nmol/L)+INS(10nmol/L)组中PEPCK的蛋白表达量均明显减少(p<0.05)；表明GLP-1、Exendin-4分别与INS联合组对PEPCK蛋白表达的抑制有一定的叠加作用；
(3)与Control组相比，LY294002(15μmol/L)组PEPCK的蛋白表达量无明显差异(p>0.05)，表明PI3K阻断剂LY294002单独应用对HepG2细胞中PEPCK的蛋白表达无明显影响；与GLP-1(10nmol/L)组相比，GLP-1(10nmol/L)+LY294002(15μmol/L)组的PEPCK的蛋白表达量明显增加(p<0.05)，但与Control组相比明显减少(p<0.05)，表明PI3K的阻断剂LY294002部分阻断了GLP-1对HepG2细胞PEPCK的蛋白表达的抑制作用；与Exendin-4(10nmol/L)组相比，Exendin-4(10nmol/L)+LY294002(15μmol/L)组的PEPCK的蛋白表达量明显增加(p<0.05)，但与Control组相比明显减少(p<0.05)，表明PDK的阻断剂LY294002部分阻断了Exendin-4对HepG2细胞PEPCK的蛋白表达的抑制作用。
结论：
1.本研究通过体外实验验证了GLP-1及其类似物Exendin-4可直接作用于人肝肿瘤细胞HepG2细胞，影响糖异生关键酶PEPCK的蛋白表达，进而起到抑制肝糖异生的作用。
2.GLP-1、Exendin-4分别与INS联合，对糖异生关键酶PEPCK的表达的抑制有一定的叠加作用。
3.在GLP-1及Exendin-4干预的前30min予PI3K阻断剂LY294002(150μmol/L)干预后，HepG2细胞中PEPCK的蛋白表达量相应较GLP-1及Exendin-4组上升，但未达到对照组水平，部分阻断了GLP-1及其类似物Exendin-4对HepG2细胞肝糖异生关键酶PEPCK表达的抑制作用。故可知，GLP-1及其类似物Exendin-4抑制HepG2细胞糖异生的作用可能是通过激活PI3K/Akt通路，使FoxO1(叉头蛋白O1，糖异生关键酶PEPCK的重要转录活化因子)磷酸化，导致FoxO1从细胞核中排除到细胞质失去转录活性，抑制PEPCK基因的转录，降低了PEPCK蛋白的表达，进而起到抑制HepG2的糖异生作用。