研究目的和背景乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官,原位乳腺癌并不致命;但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性,细胞之间连接松散,容易脱落。癌细胞一旦脱落,游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身,形成转移,危及生命。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。因此,阐明乳腺癌转移相关的分子机制及寻找预防和治疗的有效途径是目前乳腺癌癌研究的重要内容。近年来,对ErbB家族越来越受到研究者的青睐,研究发现该家族在多种肿瘤如乳腺癌,肺小细胞肺癌,胃癌,结肠癌等中起着十分重要的作用,目前已成为许多肿瘤治疗的候选靶点之一[1,2]。ErbB家族又称为EGFR家族,它属于I型受体酪氨酸激酶家族,且是一种具有跨膜结构的酶蛋白,是由EGFR/ErbB1/HER1、Neu/ErbB2/HER2、ErbB3/HER3,ErbB4/HER4 四个成员组成[1]。ErbB2又称为HER2/Neu/lien/P185,在乳腺癌中存在异常扩张[3],并与乳腺癌的发生和预后密切相关[4]。Erbin即ErbB2结合蛋白,LAP(leucine-richi repeats and PDZ domains,LRRs And PDZ)家族的重要成员之一,它不仅在ErbB信号中扮演一个重要角色,而且对上皮细胞的极化起着重要作用。Erbin的C-端含PDZ结构域[5],该结构域能与非磷酸化ErbB2蛋白结合,调节ErbB2的功能与定位[5,6]。尽管对于Erbin目前已有不少研究,但是它在肿瘤的发生、发展、转移中的作用仍然不清楚。研究方法1、Erbin在临床乳腺癌表达情况及其相关分析免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测临床乳腺癌组织芯片Erbin的表达量,组织芯片包含了患者的临床资料:性别、年龄、器官、病理诊断、分级、分期、TNM(Tumor Node Metastasis)、类型。将组织芯片常规二甲苯脱蜡7-10min×3times→梯度酒精水化(无水乙醇、无水乙醇、95%乙醇、95%乙醇、90%、85%乙醇、80%乙醇、75%乙醇、70%乙醇各1-2min)→ 0.01MpH6.0枸橼酸缓冲液抗修复抗原,高压修复3min→0.02M pH7.2-7.4 PBS(phosphate buffer solution,磷酸盐缓冲液)洗3min×3times→3%过氧化氢室温孵育10-15min以消除内源性过氧化物酶的活性→0.02M pH7.2-7.4 PBS洗3min×3times→兔抗人Erbin多克隆抗体(1:300稀释)→4℃过夜→室温复温30min→0.02M pH7.2-7.4 PBS洗3minX 3times→羊抗兔HRP标记的二抗室温30min →0.02M pH7.2-7.4 PBS洗3minX 3times→DAB显色→苏木素复染→0.1%盐酸酒精分化→自来水返蓝→常规脱水透明→中性树脂封片。运用Image-pro plus 6.0(IPP6.0)图像分析软件,分析组织芯片上每个点图片的累积光密度值(integrated optical density,IDO),IDO能反应选定区域的蛋白表达总量。每个组织点随机选取5个视野,分别测定IDO值再得出平均的IDO值为该点的累计光密度值,代表该组织点蛋白表达总量。2、Erbin稳定敲低前后对人乳腺癌细胞株体外生物学特性的影响2.1筛选Erbin高表达的乳腺癌细胞株Western Blot检测不同乳腺癌细胞株SK-3、MCF-7、435S、MD231、BT549中Erbin的表达量,筛选出Erbin高表达的乳腺癌细胞株。取20μg蛋白质,与2×SDS上样缓冲液以1:1的比例混合,在沸水煮10min,置冰上冷却2min,瞬时离心后上样,6%SDS-PAGE电泳,采用预染蛋白Marer为参照。电泳至溴酚蓝距离底部0.5cm左右即停止电泳。电泳完毕后,PAGE胶上的蛋白质用Bio-RAD微型电转移系统于4℃,300mA电转移10Ormin至PVDF(polyvinylidene fluoride,聚偏二氟乙烯)膜上。小心地用镊子取出PVDF膜,用20 ml封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST)室温孵育1 h,倒去封闭液,加入兔抗人多克隆抗体(1:1000稀释)4℃孵育过夜,25 ml PBST(Phosphate Buffered Saline with Tween-20,吐温-20磷酸盐缓冲液)洗膜4次,每次4min,加入HRP标记的羊抗兔二抗(1:5000稀释)室温孵育1h,PBST洗膜4次,前两次4 min,后两次8min。膜稍滴干后加入化学发光试剂孵育1 min,迅速在化学发光仪中曝光1min左右获取图像,以α-tubulin为内对照。2.2人Erbin稳定敲低乳腺癌细胞株的构建与鉴定前期设计并筛选出干扰效率最高的Erbin基因特异性RNAi靶序列,将该片段亚克隆转至慢病毒载体,构建Erbin敲低稳定表达载体,转染入293T细胞,获取病毒上清,检测病毒滴度,加入人乳腺癌细胞株BT549、MD231培养48小时后加入嘌呤霉素进行药物筛选。通过Western Blot鉴定获取Erbin稳定敲低的人乳腺癌细胞株MD231-shRNA-KD,BT549-shRNA-KD以及阴性对照的细胞MD231-shRNA-NC,BT549-shRNA-NC。2.3利用CCK-8,平板克隆形成实验检测Erbin稳定敲低前后对BT549、MD231体外增殖能力的影响;应用运动小室体外迁移实验(Transwell chamber)检测Erbin稳定敲低前后对BT549、MD231运动和迁移能力的影响;运用划痕实验检测Erbin稳定敲低前后对MD231运动和迁移能力的影响。2.4裸鼠局部转移模型观察Erbin稳定敲低前后对MD231体内增殖和迁移能力的影响。裸鼠乳腺脂肪垫下局部注射:将处在生长状态良好的Erbin稳定敲低的乳腺癌细胞MD231,用0.25%胰酶制备成单细胞悬液,选取20只6周龄裸鼠,雌性,随机分成两组,每组10只。将对照组和实验组细胞分别注入这两组裸鼠两侧第二乳腺下的脂肪垫内,每个部位注射2×106个细胞/100μl,4周后统一处死裸鼠,观察局部成瘤以及局部转移情况。3、Erbin稳定敲低前后对鼠源细胞株体内生物学特性的影响3.1.Erbin稳定敲低小鼠结直肠癌CT26细胞、小鼠黑色素瘤B16细胞的构建与鉴定设计鼠Erbin基因特异的RNAi靶序列,将片段亚克隆转至慢病毒载体,构建Erbin敲低稳定表达载体,转染入293T细胞,获取病毒上清,检测病毒滴度,加入鼠结肠癌细胞株CT26,鼠黑色素瘤细胞株B16培养48小时后加入嘌呤霉素进行药物筛选。通过Western Blot鉴定获取Erbin稳定敲低的鼠结肠癌细胞株CT26-shRNA-KD及阴性对照CT26-shRNA-NC;Erbin稳定敲低的鼠黑色素癌细胞株 B16-shRNA-KD 及阴性对照 B16-shRNA-NC。3.2鼠大肠癌肝转移模型的构建将生长状态良好的Erbin稳定敲低的小鼠结肠癌CT26细胞和对照组细胞,用0.25%胰酶制备成单细胞悬液,调整浓度为2X 107/ml。选取20只6周龄Babl/c小鼠,雌雄各半随机分成两组。用0.2%戊巴比妥钠麻醉Babl/c小鼠(5μl/g腹腔注射),5min后待小鼠完全麻醉。将小鼠放入无菌操作台,摆好体位,酒精棉球擦拭体表,备皮,左侧腋下沿肋弓下0.5cm,剪开3cm左右的切口,纱布按压止血。暴露脾脏,找到脾脏头部的血管和韧带将其结扎后游离脾头。用眼科镊轻轻牵拉脾尾部将脾脏拉出腹腔外,用1ml的注射器斜面朝上从脾脏尾部进针(尽量平行脾被膜进针,进针深度为lcm,若伤及脾脏可发生失血性休克导致死亡)打入1O0μ1细胞悬液(速度时间以3min为宜),可见被膜鼓起相应部位变得苍白。5min后结扎脾蒂,切除脾脏,分层缝合腹壁,酒精擦拭伤口。四周后短颈处死小鼠,切开腹壁观察肝脏转移的情况。3.3鼠黑色素瘤全身转移模型的构建将处在生长状态良好的Erbin稳定敲低的小鼠黑色素瘤B16细胞和对照组细胞,用0.25%胰酶制备成单细胞悬液。选取20只6周龄C57小鼠,雌雄各半随机分成两组,每组10只雌雄各半。将小鼠尾巴从鼠笼间隙拉出,泡在温水中lmin待血管扩张后用1ml注射器斜面朝上往尾静脉注射2× 106个细胞/100μl。三周后断颈处死小鼠,观察全身转移情况。4、Erbin 与上皮细胞间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)之间的关系Western Blot检测Erbin稳定敲低的人乳腺癌细胞株MD231-shRNA-KD,BT549-shRNA-KD以及阴性对细胞MD231-shRNA-NC,BT549-shRNA-NC 细胞全蛋白中EMT相关标志物的表达,探讨Erbin是否参与乳腺癌细胞EMT过程。5、构建ErbinPDZ结构域突变的MMTV-PyVT小鼠乳腺癌模型1.小鼠的培育及观察因为MMTV-PyVT小鼠携带鼠乳腺肿瘤病毒,小鼠可育但泌乳能力丧失,所以(MMTV-PyVT)(?)和WT(?)早杂交繁殖;此外MMTV-PyVT仅能以携带一条鼠乳腺肿瘤病毒片段的形式而存在,更增加了小鼠培育的难度。ErbinC-端PDZ结构域突变杂合子ErbinΔC/+(?)与Erbin C-端PDZ结构域突变杂合子ErbinΔC+(?)早杂交得出ErbinC-端PDZ结构域突变的纯合子ErbinΔC/ΔC。(MMTV-PyVT)(?)与ErbinC-端PDZ结构域突变的纯合子ErbinΔC/Δe(?)杂交出Erbin C-端PDZ结构域突变杂合子的MMTV-PyVT小鼠PyVT&Erbin2C/+,将 PyVT&ErbinΔC/+(?)再与ErbinΔe/ΔC 早多代杂交出 PyVT&ErbinΔe/Δe。2.小鼠的鉴定小鼠标记采用剪取小鼠脚趾的方法,将小鼠相应的脚趾剪下,用镊子夹取放入200μl的EP管(eppendorf管,离心管)内。在EP管内加入70μlA液,在PCR仪上反应(97℃1h,4℃维持)。随后取出EP管,再管内加入70μlB液4000rpm离心3min,4℃保存待用。MMTV-PyVT小鼠基因型的鉴定采用的引物有:PYVT-F 5’-GGA AGC AAG TAC TTC ACA AGG G-3’PYVT-R 5’-GGA AAG TCA CTA GGA GCA GGG-3’PYVT-pos-F 5’-CAAATG TTG CTT GTC TGG TG-3’PYVT-pos-R 5’-GTC AGT CGA GTG CAC AGT TT-3’Erbin C-端PDZ结构域突变小鼠基因型鉴定采用的引物有:Erbin-1 5’-CACTC TGTAA TCAGT TCTTA GCAG-3’Erbin-WT 5’-GGTAA GACAG AAACT GGCAC CAG-3’Erbin-MT 5’-CACTC CAACC TCCGC AAACT C-3’采用15μ1 PCR反应体系按照以下PCR反应条件得出PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳(含有1%的EB)。3.将培育出来的MMTV-PyVT雌性小鼠与ErbinC-端PDZ结构域突变杂合子的MMTV-PyVT小鼠PyVT&ErbinΔe/+雌性小鼠培育6个月左右,断颈处死小鼠后解剖观察肺脏转移的情况。瘤组织的取材,脱水,包埋以及组织切片,HE染色(hematoxylin-eosin staining,苏木精一伊红染色法)。结果1、Erbin在临床乳腺癌表达情况及其相关分析通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测乳腺癌组织芯片中Erbin的表达水平,结果显示Erbin定位在于细胞浆,在高表达时少量定位于细胞核。Erbin的表达与器官、类型、年龄、分级差异无统计学意义(P>0.05);Erbin的表达量与病理诊断(F=7.214,P=).000)、TNM(Tumor Node Metastasis)分期(F=5.9977,P=0.000)差异有显著性。2、Erbin稳定敲低前后对人乳腺癌细胞株体外生物学特性的影响2.1 通过Western Bolt从乳腺癌细胞株SK-3、MCF-7、435S、MD231、BT549中成功筛选出Erbin表达量高的乳腺癌细胞株BT549、MD231。2.2通过RNAi技术沉默人乳腺癌细胞株Erbin的表达,成功构建Erbin基因稳定敲低的人乳腺癌细胞株MD23 1-shRNA-KD,BT549-shRNA-KD以及阴性对照的细胞MD231-shRNA-NC,BT549-shRN A-NC。2.3用CCK-8检测细胞体外增殖能力,BT549细胞Erbin稳定敲低的细胞于对照组相比增长速度加快,差异具有显著性(F=13.808,P=0.001);不同时间点对于细胞体外增殖的影响差异具有显著性(F=1477.308,P=0.000);各组细胞于各组间两因素不存在交互效应(F=1.607,P=0.182)。采用单向方差分析(One-Way ANOVA)不同时间点实验组和对照组的增殖能力,除了第一天(F=0.147,P=0.719),第四天(F=0.788,P=0.425),第五天(F=0.021,P=0.893)外,其他时间点细胞组间的细胞增殖差异具有显著性。MD231细胞Erbin稳定敲低的细胞于对照组相比增长速度加快,差异具有显著性(F=28.968,P=0.000);不同时间点对于细胞体外增殖的影响差异具有显著性(F=2756.275,P=0.000);各组细胞于各组间两因素存在交互效应(F=3.804,P=0.007)。采用单向方差分析(One-Way ANOVA)不同时间点实验组和对照组的增殖能力,除了第二天(F=1.176,P=0.339),第四天(F=3.283,P=0.144),第五天(F=3.344,P 0.141)外,第七天(F=3.117,P=0.152)其他时间点细胞组间的细胞增殖差异具有显著性。平板克隆形成实验结果发现Erbin稳定敲除后的BT549细胞,MD231细胞与对照组比克隆形成率增加,差异具有显著性。(BT549细胞F=1.597,P=0.000;MD231细胞F=3.428,P=0.000)。运用运动小室体外迁移实验(Transwell chamber)结果发现Erbin稳定敲低的BT549细胞,MD231细胞与对照组相比细胞迁移能力增强,差异具有显著性(BT549细胞F=2.579,P=0.000;MD231细胞F=0.441,P=0.000)。细胞划痕实验结果发现Erbin稳定敲除的MD231细胞与对照组相比细胞迁移能力增强,差异具有显著性(MD231细胞F=94.280,P=0.000)。2.4裸鼠局部转移模型结果说明Erbin稳定敲除乳腺癌细胞株MD231局部成瘤累计体积明显小于对照组,结果具有显著性(F=8.431,P=0.010);Erbin稳定敲低乳腺癌细胞株MD231局部成瘤数目明显少于对照组,结果具有显著性(F=8.615,P=0.010);Erbin稳定敲低乳腺癌细胞株MD231局部成瘤评分明显小于对照组,结果具有显著性(F=9.707,P=0.007)。Erbin稳定敲低乳腺癌细胞株MD231局部转移累计体积明显大于对照组,结果具有显著性(F=29.64,P=0.000);Erbin稳定敲除乳腺癌细胞株MD231转移数目明显大于对照组,结果具有显著性(F=32.10,P=0.000);Erbin稳定敲低乳腺癌细胞株MD231转移评分明显大于对照组,结果具有显著性(F=35.038,P=0.000)。3、Erbin稳定敲除前后对鼠源细胞株体内生物学特性的影响3.1 Erbin稳定敲低小鼠结直肠癌CT26细胞、小鼠黑色素瘤B16细胞的构建与鉴定通过RNAi技术沉默人乳腺癌细胞株Erbin的表达,通过Western Blot鉴定获取Erbin稳定敲低的鼠结肠癌细胞株CT26-shRNA-KD及阴性对照CT26-shRNA-NC;Erbin稳定敲低的鼠黑色素癌细胞株B16-shRNA-KD及阴性对照B16-shRNA-NC。3.2大肠癌肝转移模型的构建通过大肠癌肝转移模型发现Erbin稳定敲除小鼠结肠癌细胞CT26肝脏转移瘤累计体积明显大于对照组,结果具有显著性(F=5.108,P=0.038);Erbin稳定敲除小鼠结肠癌细胞CT26肝脏转移瘤数目明显多于对照组,结果具有显著性(F=10.816,P=0.005);Erbin稳定敲除小鼠结肠癌细胞CT26肝脏转移瘤评分明显大于对照组,结果具有显著性(F=11.11,P=0.004)。3.3.黑色素瘤全身转移模型的构建通过黑色素瘤全身转移模型发现Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16肺脏重量明显大于对照组,结果具有显著性(F=5.974,P=0.028;);Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16肺脏转移个数明显多于对照组,结果具有显著性(F=21.043,P=0.001);Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16肺脏转移瘤累计体积明显大于对照组,结果具有显著性(F=21.969,P=0.001);Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16肺脏转移评分明显大于对照组,结果具有显著性(F=18.193,P=0.001)。Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16肝脏转移个数明显多于对照组,结果具有显著性(F=17.21,P=0.001);Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16肝脏转移瘤累计体积明显大于对照组,结果具有显著性(F=14.766,P=0.002)。Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16肝脏转移评分明显大于对照组,结果具有显著性(F=16.533,P=0.001)。Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16肾脏转移个数明显多于对照组,结果具有显著性(F=11.949,P=0.004);Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16肾脏转移累计体积明显大于对照组,结果具有显著性(F=11.286,P=0.005);Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16肾脏转移评分明显大于对照组,结果具有显著性(F=20.346,P=0.000)。Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16转移器官个数明显大于对照组,结果具有显著性(F=7.248,P=0.018);Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16其他脏器转移累计体积明显大于对照组,结果具有显著性(F=5.26,P=0.038);Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16其他脏器转移个数明显大于对照组,结果具有显著性(F=16.333,P=0.001);Erbin稳定敲除小鼠黑色素癌细胞B16其他脏器转移评分明显大于对照组,结果具有显著性(F=17.55,P=0.001)。4、Erbin 与上皮细胞间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)之间的关系蛋白印迹法(Western Blot)观察Erbin稳定敲低后的乳腺癌细胞株BT549、MD231中EMT相关标志物的表达,结果显示Z0-1,β-catenin,Claudin-1表达明显高于对照组。5、构建ErbinPDZ结构域突变的MMTV-PyVT小鼠乳腺癌模型1.小鼠的培育目前培育出Erbin PDZ结构域杂合突变的MMTV-PyVT雌雄小鼠和Erbin PDZ结构域纯合突变的MMTV-PyVT雄性小鼠。2.小鼠的鉴定MMTV-PyVT小鼠基因型的鉴定:MMTV-PyVT阳性小鼠可出现一条556bp有条带,MMTV-PyVT野生型小鼠这没有。Erbin小鼠基因型的鉴定:Erbin纯合子(ErbinΔC/Δe)小鼠可出现一条在300bp和400bp之间的条带;Erbin野生型(Erbin+/+)小鼠可有一条在400bp和500bp之间的条带;Erbin杂合子(ErbinΔC/+)小鼠则在300bp-400bp和 400bp-500bp有两条条带。3.Erbin PDZ结构域突变对MMTV-PyVT小鼠乳腺癌肺转移情况的影响培育出来的MMTV-PyVT雌性小鼠与Erbin C-端PDZ结构域突变杂合子的MMTV-PyVT小鼠PyVT&ErbinΔe/+雌性小鼠培育6个月左右,断颈处死小鼠后解剖观察肺脏转移的情况。采用独立样本t检验(Independent-Sample TTest)分析结果显示:Erbin PDZ结构域杂合突变的MMTV-PyVT小鼠(PyVT&ErbinΔe/+)肺脏重量与对照组相比差别不大,结果不具有显著性(F=0.279,P=0.612);Erbin PDZ结构域杂合突变的MMTV-PyVT小鼠(PyVT&ErbinΔC/+)肺脏转移的数目大于对照组,结果具有显著性(F=20.463,P=0.002);ErbinPDZ结构域杂合突变的MMTV-PyVT小鼠(PyVT&ErbinΔC/+)肺脏转移累计体积与对照组相比差别不大,结果不具有显著性(F=2.798,P=0.133);单条ErbinPDZ结构域突变的MMTV-PyVT小鼠(PyVT&ErbinΔe/+)肺脏转移的评分大于对照组,结果具有显著性(F=14.032,P=0.006)。结论:1、Erbin定位在于细胞浆,在高表达时少量定位于细胞核。Erbin的表达与年龄、分级、无明显关系,但与病理诊断,TNM(Tumor Node Metastasis)分期密切相关。2、Erbin与乳腺癌细胞的体外增值能力,克隆形成能力,迁移能力密切相关,Erbin敲低对于肿瘤细胞的转移起着重要的作用。3、Erbin敲低对小鼠结肠癌细胞、小鼠黑色素瘤系细胞的体内转移现象更明显,也就是说Erbin敲低对于鼠源肿瘤细胞的转移同样起着重要的作用。4、蛋白印迹法(Western Blot)观察Erbin稳定敲低后的乳腺癌细胞株BT549、MD231中EMT相关标志物的表达,结果显示Z0-1,β-catenin,Claudin-1表达明显高于对照组。5、目前培育出Erbin PDZ结构域杂合突变的MMTV-PyVT雌雄小鼠和Erbin PDZ结构域纯合突变的MMTV-PyVT雄性小鼠。通过观察发现ErbinPDZ结构域杂合突变的MMTV-PyVT小鼠(PyVT&ErbinΔC/+)在肺脏转移的数目以及评分上明显大于对照组,而在肺脏重量和肺脏转移累计体积上则不存在差异。