Trihelix转录因子是植物转录因子家族中发现相对较晚的一个家族,最先是作为光调控因子被人们认识,后来发现它在植物的生长发育及非生物胁迫中也具有一定的调控作用。近些年,挖掘该家族在植物非生物胁迫中的功能成为该家族成员的热门研究方向。本试验研究的对象为蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中MTGT1基因,根据MTGT1基因序列设计引物,使用基因克隆、生物信息学分析、转基因等手段,从蒺藜苜蓿中获取目的基因MTGT1,进行初步的鉴定。发现该基因与植物的非生物胁迫相关,这为研究该基因的功能奠定了基础,并提供理论依据。具体研究结果如下:1、从蒺藜苜蓿中提取总RNA,其OD260/OD280的值在1.8-2.0之间,RNA的质量较好。反转录成cDNA,利用PCR扩增技术获取目的基因MTGT1完整的片段,命名为MtGT1。将目的基因连接到载体pMD19-T上,构建了克隆载体pMD-MtGT1。2、使用DNAMAN7.0将目的基因翻译成氨基酸序列,进行生物信息学分析。得到该基因全长1109bp,开放阅读框为972bp,共编码324个氨基酸。含有一个MYB保守结构域,属于Trihelix家族的GT1亚家族。同源序列比对发现其与豆科植物的同源性较好,其中与三叶草(Trifolium subterraneu)的GT蛋白亲缘关系最近。该蛋白质属于稳定的脂溶性疏水蛋白,没有跨膜区域,也不含信号肽,二级结构显示该蛋白由α螺旋、延伸链和无规则卷曲三种结构组成,三级结构预测了它部分片段的三维结构图,发现一段与拟南芥(Arabidopsis thaliana)GT1的DNA保守结构域十分相似的区域,证明该基因属于Trihelix家族。3、通过荧光定量qRT-PCR对MtGT1基因进行基因表达量分析。结果显示,该基因在蒺藜苜蓿不同组织中的表达量含有显著差异。其中,在根中的表达量最高,花中的表达量最低,茎和叶的表达量处于二者之间。喷施浓度为10μmol/L IAA(Indole-3-acetic acid,Indol-yl-3-acetic Acid)和 10μmol/L6-BA(6-Benzylaminopurine)两种激素,表达量变化趋势为随着时间的增加,表达量先增加后降低。IAA在12h时出现第2个峰值。低温处理后,表达量是随着时间的增加先下降后上升;而干旱和盐处理则是先上升后下降。综上所述,该基因对IAA和6-BA两种植物生素以及干旱、盐、低温三种非生物胁迫均有响应,推测MtGT1基因可能参与植物的部分非生物逆境胁迫。4、将目的基因MtGT1连接到3302Y载体中,构建植物表达载体3302Y-MtGT1,然后转化农杆菌EHA105。使用农杆菌侵染拟南芥的花序,用草甘膦对下一代植株进行筛选,选取成活且生长良好的拟南芥进行DNA鉴定,鉴定出4株阳性植株,证明目的基因MtGT1被成功转入拟南芥中,并在拟南芥中表达。5、利用携带35S启动子和YFP荧光蛋白基因的3302Y-MtGT1表达载体,摇菌,活化农杆菌EHA105。将其重悬浮后的菌液注射到本生烟草(Nicotiana benthamiana)的下表皮中,暗培养48h后,使用激光共聚焦显微镜观察。结果显示该蛋白是核定位蛋白。