目的:本课题组前期研究发现蚂蟥水提取物(AEW)显著抑制深静脉血栓(DVT)形成。因此,本课题进一步从凝血系统、纤溶系统、血小板活性、全血粘度及Sirtuin 1(SIRT1)调节的炎症反应探讨AEW干预DVT形成的作用机制。方法:(1)AEW对DVT形成的影响时效关系考察:大鼠按体重随机分为假手术组、模型组和AEW(104.2 mg生药/kg/d)组。建立狭窄法诱导SD大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠灌胃给予双蒸水。给药方式1:AEW组大鼠术后1h和24h灌胃给予药物;给药方式2:AEW组大鼠术后1h、24 h、2d和3d灌胃给予药物;给药方式3:AEW组大鼠造模后第3d开始灌胃给药,连续给药5 d,每天一次。检测栓重、HE染色进行组织病理学观察。量效关系考察:动物按体重随机分为假手术组、模型组、AEW低、中、高剂量组(34.7、104.2、312.5 mg 生药/kg/d)、肝素组(200 U/kg/d)、氯吡格雷组(25 mg/kg/d)。建立狭窄法诱导大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予双蒸水;AEW组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予相应剂量AEW;肝素钠组大鼠于术后1h和24 h尾静脉注射肝素钠;氯吡格雷组大鼠于术前2 h和术后24 h灌胃给予氯吡格雷。肉眼观察血栓形态变化并称重。(2)从凝血系统、纤溶系统、血细胞数量、血小板活性及全血粘度探讨AEW干预DVT形成的作用机制动物按体重随机分为假手术组、模型组、AEW低、中、高剂量组(34.7、104.2、312.5 mg 生药/kg/d)、肝素组(200 U/kg/d)、氯吡格雷组(25 mg/kg/d)。建立狭窄法诱导SD大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予双蒸水;AEW组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予相应剂量AEW;肝素钠组大鼠于术后1 h和24 h尾静脉注射给予肝素钠;氯吡格雷组大鼠于术前2 h和术后24 h灌胃给予氯吡格雷。称量栓重,检测凝血四项、血常规、全血粘度和血小板聚集率。(3)AEW调控SIRT1抑制炎症反应防治DVT的分子机制①SIRT1下调促进炎症反应进而诱导DVT形成I.SIRT1及炎症对DVT形成的影响动物按体重随机分为15组,包括正常组,假手术0.5 h、1 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d组,造模0.5 h、1h、1d、3d、5 d、7 d、14 d组。建立狭窄法诱导大鼠下腔静脉血栓模型,于各时间点动物麻醉后颈总动脉采血,分离血栓(含静脉壁)并称重;HE染色进行组织病理学观察及炎性细胞计数;免疫组织化学法检测组织因子(TF)在血栓及静脉壁中的表达;ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-1β(IL-1β)含量;Western blot法检测血栓(包含静脉壁)中SIRT1、磷酸化p65(p-p65)、乙酰化p65(Ace-p65)及p65的表达。II.SIRT1激动剂白藜芦醇(RES)对DVT形成的影响动物按体重随机分为5组,包括假手术组、模型组、RES低、中、高剂量(25、50、75 mg/kg/d)组。建立狭窄法诱导大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予双蒸水;RES组大鼠于术前1 h和术后24 h灌胃给予相应剂量RES。分离血栓(含静脉壁)并称重;HE染色观察血栓(包含静脉壁)病理变化并进行炎性细胞计数;ELISA法检测大鼠血清IL-1β与TNF-α水平;免疫荧光法检测血栓及静脉壁SIRT1蛋白表达;Western blot法检测血栓及静脉壁SIRT1、TF、Ace-p65及p65蛋白表达;qRT-PCR检测血栓及静脉壁SIRT1 mRNA 表达。Ⅲ.SIRT1选择性抑制剂EX527对DVT形成的影响动物按体重随机分为8组,包括正常组、假手术组、假手术+RES(50 mg/kg)组、假手术+EX527(10 mg/kg)组、模型组、模型+RES(50 mg/kg)、模型+RES(50 mg/kg)+EX527(10mg/kg)、模型+EX527 组(10mg/kg)。建立狭窄法诱导大鼠下腔静脉DVT模型,正常组、假手术组和模型组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予双蒸水;RES于术前1h和术后24 h灌胃给予;EX527于术前20 min腹腔注射给予。造模25 h后处死动物,肉眼观察血栓形态并称重;Western blot法检测血栓及静脉壁SIRT1、p-p65、Ace-p65及p65蛋白表达。②AEW调控SIRT1抑制炎症反应防治DVTⅠ.AEW对SIRT1/NF-κB通路相关蛋白的影响动物按体重随机分为5组,包括假手术组、模型组、AEW低、中、高剂量组(34.7 mg、104.2、312.5 mg生药/kg/d,p.o)。建立狭窄法诱导大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠于术后1h和24h灌胃给予双蒸水;AEW组大鼠于术后1h和24 h灌胃给予相应剂量AEW。术后25 h,颈总动脉采血,称量栓重,HE染色进行组织病理学观察及炎性细胞计数;检测血清TNF-α及IL-1β水平;免疫荧光法检测血栓(含静脉壁)SIRT1蛋白表达;Western blot法检测血栓(含静脉壁)SIRT1、p-p65、Ace-p65及p65蛋白表达。Ⅱ.联用SIRT1抑制剂明确AEW调控SIRT1干预DVT形成动物按体重随机分为正常组,假手术组,模型组,模型+EX527(10mg/kg)组,AEW组(104.2 mg生药/kg/d),模型+AEW(104.2 mg生药/kg/d)+EX527(10 mg/kg)组。狭窄法诱导SD大鼠下腔静脉血栓模型,假手术组和模型组大鼠于术后1 h和24 h灌胃给予双蒸水;AEW于术后1h和24 h灌胃给予;EX527于术前20 min腹腔注射给予。术后25 h,处死动物,肉眼观察血栓形态并称重;Western blot法检测血栓(含静脉壁)SIRT1、p-p65、Ace-p65及p65蛋白表达。结果:(1)AEW对DVT形成的影响在三种给药方式下,AEW均能显著抑制DVT形成,抑制血栓炎性细胞浸润及静脉壁炎性细胞渗出。中、高剂量AEW均能抑制血栓形成。(2)从凝血系统、纤溶系统、血细胞数量、血小板活性及全血粘度探讨AEW干预DVT形成的作用机制肝素显著增加DVT大鼠血浆APTT、PT及TT值;氯吡格雷显著降低DVT大鼠血小板聚集率。AEW对凝血四项、血浆tPA及PAI-1水平、血细胞的数量、二磷酸腺苷诱导的血小板聚集率和全血粘度无影响。(3)AEW调控SIRT1抑制炎症反应防治DVT的分子机制①SIRT1下调促进炎症反应进而诱导DVT形成I.SIRT1及炎症对DVT形成的影响各时间点假手术组大鼠的血管形态与重量同正常组大鼠的无差异。造模0.5 h无血栓形成;造模1h在结扎处下端可见红色血丝;造模1d血栓较松软,呈暗红色;随着造模时间的延长,血栓逐渐机化再通。栓重呈先升后降的趋势,在1d和3d达到最大值。组织病理学结果显示,各时间点假手术组大鼠的血管壁炎性细胞渗出和静脉腔炎性细胞浸润的情况同正常组大鼠的无差异。静脉壁中性粒细胞于造模1 h及1 d时达到最大值,血栓中性粒细胞于造模1 d达到峰值;静脉壁单核细胞渗出及血栓单核细胞浸润随造模时间呈先增加后降低的趋势,均于造模5 d达到峰值。正常组及造模0.5 h组大鼠血管无TF表达;在造模1h至14 d时,TF大量表达在中性粒细胞、单核细胞、内皮细胞上及新生血管处。造模1d时大鼠血清IL-1β及TNF-α水平显著增加。同正常组相比,静脉壁及血栓SIRT1蛋白表达于造模1 d时降低75.4%,而p-p65及Ace-p65的蛋白表达分别增加185.4%和92.4%。SIRT1和Ace-p65蛋白表达于造模3-14 d时趋于正常水平,p-p65蛋白表达于造模14 d趋于正常水平。Ⅱ.SIRT1激动剂RES对DVT形成的影响RES显著降低栓重、血栓炎性细胞浸润及静脉壁炎性细胞渗出,下调血清IL-1β及TNF-α至正常水平,增加大鼠血栓及静脉壁SIRT1蛋白及mRNA表达,降低Ace-p65及TF蛋白表达。Ⅲ.SIRT1抑制剂EX527对DVT形成的影响假手术组大鼠的栓重、SIRT1、Ace-p65及p-p65蛋白表达同正常组大鼠无显著差异。RES和EX527对假手术组大鼠无影响。单独使用EX527对下腔静脉狭窄大鼠的血栓形成及各指标无影响;但同模型+RES组大鼠相比,模型+RES+EX527组大鼠的栓重、Ace-p65及p-p65蛋白表达均显著升高,静脉壁及血栓组织SIRT1蛋白表达显著降低。②AEW调控SIRT1抑制炎症反应防治DVTⅠ.AEW对SIRT1/NF-κB通路相关蛋白的影响:同模型组大鼠相比,AEW组大鼠静脉壁及血栓SIRT1蛋白表达显著增加,血栓炎性细胞渗出及静脉壁炎性细胞浸润、血清IL-1β及TNF-α水平、静脉壁及血栓p-p65及Ace-p65蛋白表达均显著降低。Ⅱ.联用SIRT1抑制剂明确AEW调控SIRT1干预DVT形成:同AEW剂量组大鼠相比,AEW+EX527组大鼠的栓重、静脉壁及血栓Ace-p65蛋白表达均显著增加、静脉壁及血栓SIRT1蛋白表达显著降低。结论:AEW具有显著防治DVT的作用,但不影响体循环的凝血系统、纤溶系统、血小板活性及全血粘度。SIRT1去乙酰化修饰NF-κB调节炎症反应,干预大鼠下腔静脉血栓形成。AEW可通过调控SIRT1抑制炎症反应来抑制DVT形成。