第一部分:IFI16可作为宫颈上皮内病变诊断与分级新指标最新数据显示,在女性肿瘤中,宫颈癌的发生率与死亡率都居第四位,持续性高危HPV感染已被认定为宫颈癌发生发展的始发因素。虽然HPV感染是一个不可或缺的因素,但这并不足以导致癌症的发生。大多数HPV感染是短暂的,而且从持续高危HPV感染到宫颈癌的发生需要漫长的过程:持续性病毒感染,宫颈上皮内病变(LSIL-HSIL),宫颈癌。LSIL属于良性病变,预后较好,70%以上的病变可在短时间内消退,HSIL阶段则为单克隆肿瘤性病变,预后差,临床主要治疗手段为手术切除。因而有效阻断LSIL进展为HSIL将会大大降低宫颈癌发病率,前提是宫颈上皮内病变的早期诊断与精准分级。宫颈上皮内病变病理诊断与分级虽有规范化诊断标准,但主观性强,把握困难,国内不同医疗单位的诊断存在严重差异。除形态学观察外,p16是目前常用的病理诊断标记物。但p16染色着色模式多样,判读比较复杂,经验不足则易做出错误的诊断。所以,目前需要研发更具稳定性的的辅助分子标记物,协助病理形态学的精确诊断分级。家族成员干扰素诱导蛋白 16(interferon gamma inducible protein 16,IFI16)是HIN200家族中的人成员蛋白。当病毒、细菌等病原微生物入侵体内环境时,IFI16作为异常双链DNA传感器,自身活化启动炎症反应,开启信号级联反应并释放炎性介质,发起天然免疫应答。本研究旨在揭示IFI16在宫颈上皮内病变中的表达特征,与目前临床应用指标p16进行对比,拟定更为明确精准的诊断标准。本研究以宫颈上皮内病变患者临床石蜡标本为研究对象,取得如下结果:1.IFI16在宫颈上皮内病变不同阶段差异性显著课题组选取119例宫颈炎,LISL,HSIL病例构建组织芯片后进行IFI16免疫组化,发现随着宫颈上皮内病变的进展,炎性-LSIL-HSIL,IFI16的表达逐渐上调且各组之间差异明显。IFI16在不同病变类型的表达差异不仅表现在不同的病例之间,在同一切片视野,不同的病变区域之间的差异仍是显著的。2.IFI16临床应用价值优于p16目前宫颈上皮内病变诊断的金标准是细胞形态改变,主要依靠分子标记物p16,故进行IFI16与p16的对比。以病理学诊断为金标准,以免疫组化强度3分为界,我们发现p16的敏感性高于IFI16,但其特异性却低于IFI16。ROC曲线分析显示p16的曲线下面积为0.801,而IFI16则为0.974,说明IFI16的诊断应用价值高于p16。3.p16表达异常病例中IFI16表达更为稳定我们选取p16表达异常的病例,进行IFI16的免疫组化染色。在p16低表达的HSIL病例中,IFI16呈现中度阳性,而在p16高表达LSIL病例中,IFI16呈现阴性。综上所述,IFI16在宫颈上皮内病变不同阶段差异性显著,且临床应用价值优于p16,故IFI16可作为宫颈上皮内病变的诊断新指标。第二部分:IFI16在宫颈癌中的表达特征及生物学行为宫颈癌的发生发展与HPV感染密切相关,作为病毒感染相关性肿瘤,在病毒持续性感染过程中,必然存在着机体的免疫应答。从机体抗病毒免疫系统角度出发,寻找宫颈癌发生发展的抑癌分子,可能对宫颈癌治疗开拓新的方向。IFI16的异常表达情况存在于多种肿瘤中,其表达与生物学效应在不同肿瘤中存在组织差异性,而在宫颈癌中未有研究。宫颈癌的发生发展伴随着HPV的持续性感染,按照前期实验结果推论,IFI16的表达也应是持续升高。但本实验中IFI16在持续性HPV感染-LSIL-HSIL-CCa的过程中呈现出先增高后降低的趋势,且IFI16的表达与宫颈癌患者的分期呈现负相关,与肿瘤最大切面积呈现负相关。明确IFI16下调与CCa发生及进展的因果关系这一问题将进一步有望阐明CCa发病分子机制,为CCa治疗寻找新的靶点。本研究通过组织,细胞及动物实验检测IFI16的生物学效应,取得如下结果:1.IFI16在宫颈癌中表达下调免疫组化显示IFI16在宫颈癌中表达低于HSIL。这种表达的下调,不仅表现在HSIL病例与CCa病例,而且在CCa伴周围HSIL病灶的病例中,IFI16在癌组织的表达同样低于HSIL组织。2.IFI16在宫颈癌中发挥抑癌效应本研究通过免疫组化进行IFI16在CCa中的表达特征及与临床指标的相关性分析。结果显示IFI16的表达与宫颈癌分期负相关,与淋巴结转移无关。首先课题组构建IFI16过表达质粒,siRNA与shRNA病毒,分别转染siha与C33a细胞。CCK8与EDU检测细胞的增殖能力,transwell检测细胞的迁移与侵袭能力,克隆形成检测细胞的克隆形成能力。结果显示干扰IFI16后,宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力均提高,而过表达IFI16使C33a细胞的增殖能力降低。裸鼠荷瘤实验显示与对照组相比,敲除IFI16组肿瘤组织体积较大,重量较重,荧光强度较强,说明IFI16可抑制宫颈癌细胞裸鼠成瘤能力。综上所述,课题组得出初步结论:IFI16在宫颈癌中发挥抑癌效应。3.IFI16在宫颈癌中下调机制初步探索课题组选取宫颈癌早期阶段——伴HSIL病灶的宫颈微小浸润癌进行免疫组化发现HSIL病灶与微小浸润病灶中IFI16的表达无显著差异。这提示IFI16的表达下调是在HSIL进展为浸润性宫颈癌后发生。综上所述,IFI16在宫颈癌中发挥抑癌效应。与HSIL相比,宫颈癌内IFI16的表达水平下降是宫颈癌变后通过某种机制导致的。第三部分:TRIM21通过泛素化IFI16促进宫颈癌进展IFI16在宫颈癌进展中发挥抑癌作用。与HSIL相比,宫颈癌中IFI16的表达下降,而且IFI16的表达水平与宫颈癌分期负相关。IFI16的下调机制或许就是肿瘤细胞从病毒免疫机制逃脱的关键环节,明确及干预IFI16的下调机制,将会在抑制宫颈疾病的恶性进展方面发挥重要作用。前期课题组通过数据库分析及提取宫颈病变组织mRNA检测发现在mRNA水平上,HSIL与宫颈癌无明显差异,这提示IFI16在宫颈癌中的表达降低与蛋白稳定性相关。本研究首先明确IFI16通过泛素化-蛋白酶体途径降解,随后通过蛋白质免疫共沉淀-质谱分析寻找其中的E3泛素连接酶,验证发现E3泛素连接酶TRIM21与IFI16结合。TRIM21也许就是所寻找的核心调控分子。TRIM21属于TRIM家族,因其普遍具有Ring-finger结构域,而被称为E3泛素连接酶家族。TRIM21包含RING、B-box,coiled-coil和PRYSPRY四个结构域。TRIM21的异常表达与多种肿瘤的发生密切相关,但其在肿瘤中的作用却存在组织差异性。在鼻咽癌,膀胱癌,神经胶质瘤等肿瘤中发挥促癌效应,而在乳腺癌,肝癌等肿瘤中发挥抑癌效应。TRIM21在宫颈癌中的作用却并无研究。检测TRIM21在宫颈癌中的生物学效应,明确TRIM21对IFI16的调控作用及具体机制,分析TRIM21-IFI16轴在宫颈癌进展中的作用,为理解抗病毒免疫应答在HPV感染导致的恶性疾病发生及进展机制提供理论依据。本研究通过组织检测,细胞实验及动物实验,取得如下结果:1.IFI16在宫颈癌中表达下调与泛素化有关课题组通过数据库分析及宫颈病变组织提取mRNA对比发现在mRNA水平上,HSIL与宫颈癌并无统计学差异,这提示IFI16在宫颈癌中的表达降低与蛋白稳定性相关。随后通过添加泛素化蛋白酶体抑制剂MG132与自噬溶酶体途径抑制剂氯喹确定IFI16通过泛素化-蛋白酶体途径降解。故IFI16在宫颈癌中表达下调与泛素化有关。2.TRIM21与IFI16结合并在蛋白水平上调控IFI16本研究通过Co-IP实验,验证IFI16与TRIM21在siha以及293t工具细胞结合,随后通过GST-pull down实验证明二者可直接结合。在siha中干扰TRIM21后Western Blot检测IFI16蛋白水平发现,与对照组相比,干扰TRIM21组IFI16的蛋白水平上调,过表达则相反。在免疫荧光中,二者也有如此表达关系,而且TRIM21与IFI16存在共定位。免疫组化显示二者在组织水平存在表达的负相关性。以上结果说明TRIM21可负性调控IFI16。3.TRIM21在宫颈癌中的生物学效应通过免疫组化进行TRIM21在CCa中的表达特征及与临床指标的相关性分析。结果显示TRIM21在宫颈癌内高表达且与宫颈癌分期正相关。CCK8与EDU显示干扰TRIM21后细胞的增殖能力减弱,transwell显示干扰TRIM21后细胞的迁移与侵袭能力减弱,克隆形成显示干扰TRIM21后细胞的克隆形成能力减弱。而裸鼠荷瘤实验显示敲除TRIM21后肿瘤组织体积、重量、荧光强度均减弱。至此,课题组得出结论:TRIM21在宫颈癌中发挥促癌效应。4.TRIM21通过下调IFI16促进宫颈癌进展为证明TRIM21通过调控IFI16促进宫颈癌进展,课题组首先验证TRIM21是否调控IFI16的下游,WB显示干扰IFI16后,IL-1β前体增多,而过表达TRIM21后也产生相同的效应。随后进行回补实验,干扰TRIM21导致的IFI16上调被干扰IFI16所回补。siha干扰TRIM21后细胞的增殖,侵袭,迁移,克隆形成能力均减弱,而干扰IFI16可以回补这种效应,使细胞的增殖,侵袭,迁移,克隆形成能力更接近对照组。裸鼠荷瘤实验显示干扰TRIM21后裸鼠荷瘤所形成的肿瘤体积减小,重量下降,荧光强度减弱,而这些均能被干扰IFI16所回补。据此,得出结论TRIM21通过IFI16促进宫颈癌进展。5.TRIM21通过泛素化调控IFI16过表达或干扰TRIM21后IFI16蛋白水平呈现负相关的变化而mRNA水平无变化,加之TRIM21是著名的E3泛素连接酶,考虑泛素化途径调控。放线菌酮蛋白示踪实验显示干扰TRIM21后IFI16的蛋白稳定性上调,而泛素化实验证实过表达TRIM21导致IFI16的泛素化水平上升。得出结论TRIM21通过泛素化调控IFI16。综上所述得出结论:TRIM21通过泛素化下调IFI16,促进宫颈癌进展。