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背景近年来,国内乳腺癌的发病率逐渐提高,已跃居女性常见恶性肿瘤的首位,严重影响女性的生命健康。化疗作为乳腺癌常规治疗手段,却不可避免的出现药物毒副作用、化疗耐药的现象。针对这一问题,在传统治疗方法基础上,分子靶向治疗已成为新的突破口。在前期研究中,我们利用乳腺癌组织样本证实了细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase 1,CHK1)与乳腺癌新辅助化疗获得性耐药相关。据报道CHK1是肿瘤治疗领域中很有前景的靶向干预分子。但目前,其靶向作用在各实验室的研究结果并不一致,并且CHK1靶向治疗乳腺癌的调控机制尚不清楚。雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)是评估乳腺癌预后的重要分子标志物。目前,未见关于乳腺癌ER、PR、HER2分子异质性与CHK1靶向干预的作用关系的报道。因此,有必要对CHK1在乳腺癌靶向治疗中的调控机制进行深入探讨,明确CHK1在具有不同ER、PR、HER2分子表征的乳腺癌中的靶向干预价值。本研究以CHK1与ER、PR、HER2的关系为出发点,揭示了在乳腺癌不同遗传背景下,靶向干预CHK1在联合阿霉素(Adriamycin,ADR)化疗与单剂抗肿瘤效应中的作用机制,为CHK1在乳腺癌中的靶向用药提供依据。方法利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析了乳腺癌中CHK1的表达模式与ER、PR、HER2的共表达关系。在具有不同ER,PR和HER2表达模式的乳腺癌中,使用Kaplan Meier Plotter进行了 CHK1的生存分析。通过体外诱导耐药,构建MDA-MB-231细胞的阿霉素耐药株(MDA-MB-231/ADR)。在 ER+/PR+/HER2-(MCF-7、T47D)和 ER-/PR-/HER2-(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-231/ADR)中,将 CHK1 野生型及其激酶突变体(CHK1-S317A/S345A)的重组质粒、靶向CHK1的siRNA(si-CHK1-1、si-CHK1-2)、相应的对照分别进行转染,并通过real-time quantitative PCR(RT-qPCR)以及Western-Blot检测过表达与干扰效率。通过药物敏感性测定和细胞凋亡分析,检测靶向干预CHK1对阿霉素化疗敏感性的影响。利用RT-qPCR和Western-Blot检测在阿霉素治疗前后,CHK1基因表达与蛋白磷酸化水平的变化。基于联合转录组分析的初筛与Western-Blot的验证,揭示了靶向干预CHK1调节阿霉素化疗敏感性的作用机制。基于微阵列数据分析、表观遗传学调控方式初步筛选、siRNA技术、RT-qPCR和Western-Blot,明确了乳腺癌中阿霉素对CHK1基因表达的调控机制。增殖能力检测(CCK8实验、EdU实验、克隆形成实验)与细胞周期和凋亡分析验证了靶向抑制CHK1对ER+/PR+/HER2-细胞的抗肿瘤效应,并进一步地基于微阵列数据分析与western blot进行了机制研究。结果1、CHK1表达模式与生存分析:TCGA数据库的分析结果表明CHK1在乳腺癌中高表达,并与ER/PR的共表达网络密切相关。Kaplan Meier Plotte的生存分析表明,在乳腺癌中,CHK1低表达预示着更高的总体生存率和无复发生存率。2、靶向抑制CHK1增强了 ER-/PR-/HER2-细胞对阿霉素化疗的敏感性:CCK-8实验和凋亡分析表明,敲低CHK1增强了 ER-/PR-/HER2-细胞及其耐药株对阿霉素的化疗敏感性,而这种致敏效应并不存在于ER+/PR+/HER2+细胞。3、阿霉素对CHK1的激活依赖于ER/PR的状态:RT-qPCR和Western-Blot的结果表明,在ER-/PR-/HER2-细胞中,阿霉素促进了 CHK1的表达以及蛋白磷酸化(Chk1-Ser-317 和 Chk1-Ser-345),而在 ER+/PR+/HER2-细胞中阿霉素明显抑制了 CHK1的表达。此外,分别检测了过表达CHK1及其激酶突变体(CHK1-S317A/S345A)对阿霉素敏感性的作用,结果证实,CHK1激酶活性是ER-/PR-/HER2-细胞抵御阿霉素损伤的关键。山东大学硕士学位论文4、在ER-/PR-/HER2-细胞中,靶向抑制CHK1促进阿霉素化疗敏感性的机制:细胞周期分析的结果显示,阿霉素诱导了 ER-/PR-/HER2-细胞G2/M期阻滞。进一步地,基于转录组图谱的联合分析与Western-Blot验证发现,在阿霉素作用于ER-/PR-/HER2-细胞的情况下,靶向抑制CHK1通过上调UBE2S、下调BubR1和cyclin B1引起细胞周期阻滞障碍,并促进了 MSX2和BIM介导的凋亡作用。5、CENPF介导了阿霉素对CHK1的转录调控:通过基因芯片分析、表观遗传学调控方式的初步筛选、小干扰RNA技术、RT-qPCR和Western-Blot,我们发现在乳腺癌中CENPF能介导阿霉素对CHK1的转录调控,并且在ER+/PR+/HER2-细胞中是被阿霉素抑制的,而在ER-/PR-/HER2-细胞中则是转录激活作用。6、靶向抑制CHK1对ER+/PR+/HER2-乳腺癌具有直接杀伤作用:CCK-8实验、EdU实验、克隆形成实验以及凋亡分析的结果表明,在ER+/PR+/HER2-细胞中,靶向抑制CHK1表现出直接杀伤作用,但这种效应并不存在于ER-/PR-/HER2-细胞中。另外,利用Kaplan Meier Plotte针对CHK1在不同ER、PR状态的乳腺癌患者中的生存分析也支持了上述结果。7、Fas、p21和Eg5介导了 CHK1对ER+/PR+/HER2-细胞生存的调控:基因芯片分析、细胞周期分布检测和Western-Blot的结果表明,在ER+/PR+/HER2-细胞中,靶向抑制CHK1引起Fas和p21的上调与Eg5的下调,从而引起细胞周期阻滞与凋亡的发生。结论在乳腺癌中,CHK1可存在两种角色:一是条件诱导型,二是生存必需型,而这种角色的变换主要取决于ER/PR的状态,从而导致靶向抑制CHK1在ER-/PR-/HER2-乳腺癌中可作为阿霉素化疗致敏剂,而在ER+/PR+/HER2-乳腺癌中作为独立损伤因素。在ER-/PR-/HER2-乳腺癌中,CHK1被阿霉素激活后,能通过有丝分裂检查点复合物(Mitotic Checkpoint Complex,MCC)-后期促进复合物(Anaphase-promoting Complex/cyclosome,APC/C)-cyclin B1 轴介导的细胞周期停滞以及MSX2和BIM介导的细胞凋亡,来影响阿霉素化疗敏感性。在ER+/PR+/HER2-乳腺癌中,阿霉素诱导CENPF-CHK1转录调控轴受抑,靶向抑制CHK1主要表现为由p21,Eg5和Fas介导的直接杀伤效应。因此,准确定位CHK1在不同ER/PR状态下的作用,是合理靶向用药的关键。