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免疫性血小板减少症（ITP）是一种多因素介导的自身免疫性出血性疾病,特点是血小板破坏过多和/产生减少,ITP约占临床上出血性疾病的30%左右。与许多自身免疫性疾病一样,免疫性血小板减少症的发生发展与复杂的免疫系统失调有关。最初认为,ITP的出血现象是由于血浆抗体攻击血小板自身抗原所致。自身抗体不仅破坏血小板,而且抑制血小板的产生和骨髓中巨核细胞的成熟。虽然自身抗体在ITP的发病机制中起着关键作用,但仅有50%左右的ITP患者体内可以检测到自身抗体。因此,传统观点已被更为复杂的机制所取代,如调节性T细胞、调节性B细胞和抗原提呈细胞介导的血小板生成受损和免疫效应紊乱。另外,ITP患者血浆白细胞介素（interleukin,IL）-35、IL-10 和转化生长因子（transforming growth factor,TGF）浓度降低等因素对ITP的发病也起到重要作用。近年来,实验和临床证据表明,一些自身免疫性疾病如类风湿关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）和ITP与自噬活动紊乱密切相关。自噬相关基因的缺失和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的过度表达在ITP中也有报道。这些发现可能有助于进一步解释ITP患者免疫失耐受的原因。自噬也称为自噬—溶酶体途径,是真核生物体内的一种高度保守的生物学过程,作用是将有缺陷的细胞器和大分子传递到溶酶体,形成自噬溶酶体进行分解消化。自噬被分为多个部分:起始、延伸、融合和分解。其中Beclinl（酵母中的Atg6）特异性参与哺乳动物的自噬,它通过参与自噬Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的组装,完成自噬的起始阶段。在延伸阶段,LC3的募集和定位在自噬体形成中起着至关重要的作用,是评价自噬水平的重要标志。在这一过程中,定位于细胞质的LC3I被Atg4切割成LC3Ⅱ,然后与Atg3及磷脂酰乙醇胺形成复合物,组成自噬小体,因此,LC3Ⅱ的含量代表自噬小体的丰度。p62也被称为sequestosome 1（SQSTM1）,可以通过泛素化选择性降解底物。p62负责将错误折叠的或不需要的蛋白质装载到自噬体中,用于溶酶体降解,它作为一个开关,将自噬转化为一种低效的形式。作为自噬的经典底物,p62的增加表明自噬减少或降解受损蛋白的能力降低。PI3K/Akt/mTOR信号通路是调节自噬的一个重要的信号通路,通过调控下游信号分子,参与免疫反应的调节和炎症因子的释放。mTOR是PI3K/Akt/mTOR信号通路中的关键激酶和负调控因子,在生理条件下和环境应激条件下,mTOR可通过感知细胞内营养水平调控细胞增殖、生长、存活和血管生成。当细胞缺乏营养物质时,mTOR通过诱导自噬抑制细胞内代谢,并恢复胞质成分向细胞提供营养物质。Akt在PI3K通路中的中心作用使其成为最活跃的下游效应因子之一。Akt与GPIbα的胞质结构域相互作用,并根据vWF GPIbα的相互作用转导信号,导致血小板激活。PTEN作为自噬的关键阳性调节分子,可阻断该通路对自噬的抑制作用,从而激活自噬,形成自噬小体。Hou等人在体外实验观察到靛玉红可以恢复ITP患者CD4+T细胞的程序性细胞死亡1（PD1）和PTEN的表达,进而导致Akt/mTOR通路的衰减,维持ITP患者T细胞的稳态。因此,我们可以推测,PTEN突变导致PI3K/Akt/mTOR通路的激活和自噬的抑制,并在ITP的启动和进展中发挥作用。自噬不仅参与细胞发育、肿瘤抑制、细胞内稳态、饥饿适应、衰老、先天免疫等一般生理过程,而且在维持造血微环境稳态及造血干细胞、巨核细胞、血小板功能中也发挥着重要作用。自噬相关基因（Atgs）缺失的动物模型已经证实,自噬对于正常的巨核细胞生成和维持血小板功能是必不可少的。然而,过度或减弱的自噬都会导致病理情况。新近研究发现,ITP小鼠与正常小鼠相比,前者的特征是出现未成熟巨核细胞/血小板和祖细胞的频率更高,以及存在明显异常的自噬活动。ITP患者中也存在异常的自噬活动,mTOR通过过度表达抑制自噬活动,继而影响造血干细胞的表面标记物（如CD41、CD61）的表达以及巨核细胞的形成和分化,导致血小板的功能和数量下降,最终导致ITP发病。除此之外,自噬在维持T细胞的稳态和生存作用中也发挥着重要作用。许多基因模型也已证实了自噬对T细胞的特定作用,例如,Atg5-、Atg7-、Atg3-T细胞小鼠的淋巴和脾脏中,T细胞数量和有效增殖能力显著减少,凋亡水平增加。本研究以临床样本为基础,通过蛋白质谱测定差异蛋白,通过Real-time PCR测定自噬相关蛋白Beclinl,LC3I,P62及自噬通路蛋白PTEN,PI3K,Akt,mTOR的mRNA表达情况,探究ITP中异常的自噬活动。通过体外培养Dami细胞,使用雷帕霉素增强Dami细胞自噬活动,诱导巨核细胞分化发育,从细胞水平及分子水平探讨自噬活动异常在ITP发病机制中的作用。探究ITP中异常的自噬活动有望深入了解ITP的免疫失耐受机制,寻求新的靶向治疗方法。第一部分ITP中存在自噬相关蛋白的异常表达目的:探讨ITP患者中自噬相关蛋白的差异表达情况;探讨ITP患者自噬关键蛋白 Beclinl,LC3I,P62 及自噬通路调节蛋白 PTEN,PI3K,Akt,mTOR的表达情况。方法:（1）收集20例急性期ITP患者外周血及骨髓血,20例健康供者外周血及骨髓血于EDTA管中;（2）应用Ficoll-Paque密度梯度离心法对每个样本进行单个核细胞提取;（3）应用蛋白质谱分析确定差异表达蛋白;功能富集分析确定与自噬相关的差异蛋白;（4）应用Real-time PCR检测ITP患者组及对照组骨髓及外周血中Beclinl,LC3I,P62,PTEN,PI3K,Akt,mTOR的表达,进一步验证ITP患者自噬活动异常。结果:（1）经蛋白质谱检测显示:与正常对照相比,ITP患者自噬相关蛋白HSPA8、PARK7、YWHAH、ITGB3表达水平下调,自噬相关蛋白CSF1R表达上调,提示自噬活性异常参与ITP的发生发展;（2）经Real-time PCR检测显示:与正常对照组的外周血单个核细胞（PBMCs）相比,ITP患者组LC3I及P62的mRNA表达水平升高,骨髓单个核细胞（BMMCs）结果呈现相同趋势;与正常对照组BMMCs相比,ITP患者中Beclin1的mRNA表达水平升高,而PBMCs表达呈相反趋势。（3）经Real-time PCR检测显示:与正常对照组的PBMCs相比,ITP组的Akt及mTOR的mRNA表达水平增高,PTEN及PI3K表达表达水平下降,BMMCs中的mRNA结果除Akt并未表现出明显的统计学差异外,其余结果与PBMCs趋势相同,进一步验证该通路参与ITP的发生发展。结论:ITP患者自噬功能失调,存在自噬相关蛋白表达及活性异常,自噬异常可能参与ITP发生发展。第二部分 雷帕霉素通过增强Dami细胞自噬活动诱导巨核细胞分化发育目的:通过体外培养Dami细胞,使用不同剂量浓度的雷帕霉素调节自噬活动,分析自噬活性变化后巨核细胞分化及成熟情况,以探究自噬水平改变对巨核细胞分化发育的影响。方法:（1）通过不同浓度的雷帕霉素作用于Dami细胞系,增强自噬活性;（2）应用流式细胞术检测Dami细胞CD41+表达率,从细胞分子水平上探究自噬活性改变对巨核细胞分化的作用;（3）应用流式细胞术检测Dami细胞在雷帕霉素作用下的多倍体（4N）表达,显微镜下观察对巨核细胞发育的影响。结果:（1）通过雷帕霉素增强Dami细胞自噬表达水平,流式细胞技术检测巨核细胞CD41+表达率,结果表明,CD41+表达率明显升高,且呈剂量依赖性,证明雷帕霉素增强自噬水平,促进巨核细胞分化;（2）通过雷帕霉素增强Dami细胞自噬表达水平,进行DNA倍体化分析,结果表明,4N 比例明显升高,且呈剂量依赖性,证明雷帕霉素增强自噬水平,改善巨核细胞成熟度。结论:通过比对不同剂量的雷帕霉素对Dami细胞自噬、成熟及分化的影响,证明了自噬在巨核细胞分化和代谢调控中所发挥的重要作用,这可能为ITP的自噬靶向治疗提供新的策略。