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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)作为我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率居我国恶性肿瘤第三位,约占全球肝癌发病人数的45%,给我国人民的生命健康造成严重的危害。目前HCC的治疗以手术切除为主,但由于早期难以诊断,中晚期易有远处转移失去手术机会,放疗、化疗预后较差,因此免疫细胞治疗愈来愈受到重视。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞免疫治疗技术通过将抗体的高亲和力与T淋巴细胞的杀伤能力相结合,从而可特异性地靶向肿瘤组织高表达的抗原,对肿瘤细胞进行杀伤。经历多年的技术发展,CAR-T细胞免疫治疗已在血液系统恶性肿瘤取得了突破性进展,但在实体肿瘤的治疗方面还未见到明显疗效。其中合适的靶抗原选择对CAR-T细胞的治疗至关重要。c-Met作为肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)受体,在肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌等肿瘤组织中异常高表达,而在正常组织及癌旁非肿瘤组织中低水平表达或不表达。HCC中高表达的c-Met通过与配体HGF结合,可持续性激活HGF/c-Met信号通路,使得肝癌细胞异常增殖,抑制其凋亡并增强其迁移与侵袭能力。因此c-Met可以成为肝细胞癌免疫治疗的潜在分子靶点。本文在前期制备的全人源c-Met Fab抗体基础之上,通过构建c-Met CAR慢病毒载体,转染T淋巴细胞制备c-Met CAR-T细胞,观察其对c-Met阳性肝癌细胞的杀伤作用,为肝癌的临床治疗提供新的免疫细胞治疗方法。研究方法:1.以前期实验室制备的具有高亲和力的全人源抗c-Met Fab为模板,利用基因工程技术制备抗c-Met scFv,将c-Met sc Fv段与含有CD8TM,CD28,CD137,CD3ζ的慢病毒载体重组,构建三代c-Met CAR慢病毒载体,并以此为模板构建二代c-Met CAR慢病毒载体。基因测序验证所构建的c-Met CAR慢病毒表达载体的正确性。采用PEI转染试剂将c-Met CAR慢病毒载体质粒转染至X-293T细胞中,通过Western blot检验其在X-293T细胞中的表达。运用病毒包装技术包装制备c-Met CAR慢病毒,运用PEG-8000对病毒进行浓缩,并通过批量快速病毒滴度法检测病毒滴度。2.使用淋巴细胞分离液对健康志愿者的外周血进行分离,提取外周血中的PBMC,使用抗CD3抗体、抗CD28抗体对PBMC进行激活,加入IL-2促进细胞扩增,获得活化的T淋巴细胞。将c-Met CAR转染至T淋巴细胞,制备c-Met CAR-T细胞,采用流式细胞术检测其感染效率。3.通过流式细胞术筛选出c-Met表达阳性的肝癌细胞株。通过细胞免疫荧光的方法标记HepG2细胞,并与c-Met CAR-T细胞共培养12 h,观察与CAR-T细胞的结合情况。采用CCK-8法检测c-Met CAR-T细胞在不同效靶比时对肝癌细胞株HepG2,Bel-7402的杀伤作用,比较在效靶比为10:1时对shMet-HepG2的杀伤作用。将活化的T细胞与CD19 CAR-T细胞设立对照。4.制备的c-Met CAR-T细胞与c-Met阳性肝癌细胞共培养24h后,收集培养上清,通过ELISA法检测c-Met CAR-T细胞在c-Met阳性肝癌细胞的刺激下,细胞因子IL-2与IFN-γ的分泌情况。将活化的T细胞与CD19 CAR-T细胞设立对照。5.筛选Luciferase标记的HepG2细胞稳定株,小鼠单侧腋下成瘤后,于瘤旁注射c-Met CAR-T细胞,每次注射前进行活体成像,检测c-Met CAR-T细胞在体内对肝癌的抑制作用。研究结果:1.成功构建三代c-Met CAR慢病毒载体质粒(c-Met-28-137-3ζ),并以此为模板构建了二代c-Met CAR慢病毒载体质粒(c-Met-28-3ζ、c-Met-137-3ζ),基因测序结果显示质粒序列与设计序列一致。Western blot检测CD3ζ的表达,条带大小与理论值一致。结果显示各c-Met CAR慢病毒载体质粒可在真核细胞X-293T细胞内有效表达。包装制备c-Met CAR慢病毒并进行浓缩,浓缩后的病毒滴度约为5×10~8 IFU/ml。2.慢病毒感染活化后的T细胞,制备c-Met CAR-T细胞。流式细胞术检测结果显示c-Met CAR在T细胞中的表达率为46.3%~57%。3.通过流式细胞术筛选出高表达c-Met的肝癌细胞株HepG2与Bel-7402。CCK-8结果显示,在效靶比为20:1,10:1,5:1,2:1时,三代c-Met CAR-T细胞对HepG2细胞的杀伤效率分别为80.23±4.04%、72.4±2.42%、60.93±2.3%、53.07±3.11%,c-Met CAR-T细胞的杀伤效率均与CD19 CAR-T细胞和活化的T细胞具有统计学差异(P<0.05)。与二代c-Met CAR-T细胞相比没有统计学差异(P>0.05)。在效靶比为10:1时,c-Met CAR-T细胞对低表达c-Met的sh Met-HepG2细胞的杀伤能力低于高表达c-Met的Hep G2细胞(P<0.05),而CD19 CAR-T细胞与活化的T细胞对HepG2与shMet-HepG2细胞的杀伤能力无统计学差异(P>0.05)。4.ELISA结果显示,在效靶比为10:1时,c-Met-28-137-3ζ、c-Met-137-3ζ、c-Met-28-3ζCAR-T细胞与HepG2细胞共培养后,细胞上清IFN-γ含量分别为2066.7±251.66 pg/ml、2013.2±202.5 pg/ml、1606.7±275.92 pg/ml,结果表明拥有共刺激因子CD137的二代以及三代c-Met CAR-T细胞分泌的IFN-γ量与没有共刺激因子CD137的二代c-Met CAR-T细胞相比有统计学差异(P<0.05)。上述各组培养上清中的IL-2的含量分别为1496.67±230.29 pg/ml、1133.33±61.1 pg/ml、1273.33±46.19 pg/ml,结果表明三代c-Met CAR-T细胞分泌的IL-2高于二代c-Met CAR-T细胞分泌的IL-2(P<0.05)。而c-Met CAR-T细胞与低表达c-Met的shMet-HepG2共培养时分泌的IFN-γ与IL-2低于与高表达c-Met的HepG2细胞共培养时的分泌量(P<0.05)。5.活体成像结果显示,c-Met CAR-T细胞在体内能抑制HepG2细胞的增殖,c-Met-28-137-3ζCAR-T细胞组、c-Met-137-3ζCAR-T细胞组、c-Met-28-3ζCAR-T细胞组与活化的T细胞组在体内实验的抑瘤率分别为65.3%、49.8%、43.1%、6.7%。c-Met CAR-T细胞组抑制效果高于对照组(P<0.05),三代c-Met CAR-T细胞抑制效果高于二代c-Met CAR-T细胞(P<0.05)。结论:1.构建了三代c-Met CAR(c-Met-28-137-3ζ)、二代c-Met CAR(c-Met-28-3ζ、c-Met-137-3ζ)慢病毒表达载体,包装制备c-Met CAR慢病毒,制备了三代、二代c-Met CAR-T细胞。2.三代、二代c-Met CAR-T细胞可特异性地杀伤c-Met阳性的肝癌细胞,能够分泌细胞因子IFN-γ与IL-2。并且随着靶细胞c-Met表达量的降低,c-Met CAR-T细胞的杀伤能力与细胞因子分泌也随之下降。3.c-Met CAR-T细胞能够在体内有效抑制c-Met阳性肝癌的生长,三代c-Met CAR-T细胞比二代c-Met CAR-T可更有效地抑制肝癌生长。