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糖尿病肾脏疾病(diabetickidney disease,DKD)是一种严重的糖尿病微血管并发症,也是导致终末期肾衰竭最主要的原因。机体固有免疫失衡导致的持续微炎症状态在DKD的发生发展中发挥重要作用。炎症小体的异常活化是固有免疫失衡的重要方面。炎症小体是由胞浆型模式识别受体、ASC蛋白及caspase 1装配而成的大分子复合物,可以感受细胞内多种危险信号的刺激而组装并活化。活化的caspase1是炎症小体的功能效应单元,其作用表现为促进炎症因子的生成及引发细胞焦亡。在目前已发现的炎症小体中,以NLRP3炎症小体的研究最为广泛而深入。经典的NLRP3炎症小体通路依赖caspase 1的活化。糖尿病状态下,caspase 1引发的 IL-1β和IL-18的成熟和释放(NLRP3/caspase 1/IL-1β/IL-18)与肾脏内皮功能紊乱、肾小管间质纤维化及足细胞损伤密切相关,但是caspase 1引发的细胞焦亡在DKD中的作用还有待深入。目前DKD的治疗手段有限,由于抑制NLRP3炎症小体途径可以表现出明显的肾脏保护作用,以NLRP3炎症小体为靶点的治疗有望成为治疗DKD的新途径。糖肾方(Tangshenformula,TSF)是本课题组李平教授继承前人经验并结合自身临床实践和现代科学理论拟定的中药复方,临床研究已经表明该药物有助于减轻2型糖尿病肾脏疾病患者的尿蛋白排泄率并改善肾小球滤过率,基础研究表明TSF具有抗炎、抗纤维化、抗氧化、调节脂质代谢等多方面的药理作用。本研究旨在从调节NLRP3炎症小体经典途径及细胞焦亡这一角度进一步阐明TSF治疗DKD的药理机制。目的:1.阐明NLRP3炎症小体经典途径异常活化引起的炎症因子释放和细胞焦亡是导致糖尿病肾脏损伤的重要机制。2.明确中药糖肾方能够通过调节NLRP3炎症小体经典途径减轻炎症及细胞焦亡,从而发挥肾脏保护作用。方法:1.动物实验分组、糖尿病肾脏疾病大鼠模型的建立及给药方式:39只6周龄SD大鼠随机分为对照组(13只)、DKD组(13只)、DKD+TSF组(13只)。对DKD及DKD+TSF组大鼠行右侧肾切除术,术后一周腹腔注射链脲佐菌素(STZ),注射STZ 72小时后,以尾尖血糖大于16.7mmol/L确认糖尿病状态;对照组大鼠行假手术,术后一周腹腔注射枸橼酸钠缓冲液。从注射STZ/枸橼酸钠三天后开始进行药物干预,TSF+DKD组给予TSF灌胃20周(2.4g/Kg体重/日),其余两组给予蒸馏水灌胃。实验期间监测血糖、体重及尿量,实验结束时测定血清肌酐、尿素氮、血清IL-1 β水平、24h尿蛋白(24h-UP)水平,对肾脏进行取材用于后续实验。2.组织学检测:对肾组织进行H&E、masson及PAS染色,评估病理损伤情况;免疫组化检测NLRP3及IL-1β的在肾组织的表达情况;提取肾组织蛋白及RNA,检测NLRP3、caspase 1、ASC蛋白及IL-β的mRNA及蛋白表达情况。3.筛选细胞刺激条件及TSF细胞毒实验:以不同浓度的AGEs(200ug/ml、400ug/ml)刺激HK-2细胞,用ELISA实验检测不同时间点(12h、24h、48h)细胞上清液的IL-β水平,用caspase 1活性检测试剂盒检测不同时间点caspase 1活性,根据IL-β水平和caspase 1活性确定本实验的刺激条件。根据CCK8实验结果并结合前期研究基础确定TSF的干预浓度。4.细胞实验分组、干预方式及检测指标:HK-2细胞分为对照组、AGEs刺激组、AGEs+TSF组、AGEs+TSF+NLRP3炎症小体激动剂(尼日利亚菌素,nigericin)组。其中AGEs刺激组又设12h、24h、48h三个观察组;AGEs+TSF组又设两个不同浓度(250ug/ml 和 500ug/ml)TSF 观察组;AGEs+TSF+nigericin 组又设两个不同浓度(250ug/ml和500ug/ml)TSF观察组。TSF干预时间为48小时,nigericin干预时间为1小时。实验结束时,检测各组细胞上清液中IL-1 β水平,细胞裂解液中caspase 1的活性,提取蛋白并用western blot(WB)实验检测NLRP3、caspase 1、ASC、IL-1 β的蛋白质表达情况。PI染色观察各干预组细胞的膜完整性,TUNNEL实验检测DNA损伤情况。5.细胞实验分组、干预方式及细胞焦亡的检测:将HK-2细胞分为对照组、AGEs 刺激组、AGEs+YVAD(caspase 1 抑制剂)组、AGEs+TSF 组。AGEs 刺激组:干预方式为400ug/mlAGEs干预48h;AGEs和YVAD共刺激组:先加入10ug/ml YVAD 预处理 30 分钟,再加入 400ug/mlAGEs 和 10ug/ml YVAD 干预 48小时;AGEs+TSF 组:400ug/mlAGEs 和 500ug/mlTSF 共同干预 48h。干预结束时检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的释放及细胞裂解液中ATP的水平;对活细胞进行Calcein-AM/PI双染色,用免疫荧光实验对固定后的细胞进行caspase 1 检测;用 WB 对 caspase 1 的活性形式 cleavedcaspase 1(P20)、焦亡效应分子GSDMD/GSDMD-N及NLRP3的蛋白表达进行检测。结果:1.TSF可以降低糖尿病肾脏疾病大鼠的尿蛋白水平(24h-UP),改善全身炎症状态(血清IL-β 水平)及肾组织病理损伤(纤维化、系膜基质增生、小管损伤),同时抑制肾脏中NLRP3炎症小体各组分分子的mRNA和蛋白表达及其下游炎症因子IL-β在肾组织的表达。2.TSF可以抑制AGEs诱导的HK-2细胞中NLRP3炎症小体的活化,表现为细胞上清液中分泌型IL-1 β的减少、caspase 1酶活性降低、NLRP3炎症小体各组分分子的蛋白质表达水平下调,且有剂量依赖效应。TSF干预的同时应用NLRP3炎症小体激动剂,可以恢复AGEs诱导NLRP3炎症小体的活化及下游IL-1 β的释放。TSF减少AGEs引起的细胞膜及DNA损伤。3.TSF抑制AGEs诱导的HK-2细胞焦亡。AGEs刺激的HK-2细胞较对照组相比死亡率明显增加,表现为细胞外LDH升高、胞内ATP浓度降低、PI染色阳性细胞增多、Calcein染色阳性细胞数减少、caspase 1阳性表达的细胞增加、焦亡效应分子GSDMD/GSDMD-N和NLRP3分子的表达上调。而应用caspase 1抑制剂干预,不但使死亡细胞率明显下降,还显著抑制经典焦亡通路分子的表达,证明细胞发生了依赖caspase 1的死亡,即焦亡。TSF的干预明显抑制了 AGEs诱导的细胞焦亡及经典焦亡途径的分子表达。结论:1.TSF通过抑制NLRP3炎症小体经典途径的活化,减少炎症因子的生成,缓解糖尿病肾损伤。2.AGEs刺激的HK-2细胞发生了依赖caspase 1的焦亡。TSF通过抑制NLRP3炎症小体的活化减少AGEs诱导的HK-2细胞焦亡的发生。